八重樱用日语怎么说:Rho/ Rho激酶信号通路与缺血性脑血管病_济南军区总医院神经内科

ho/ Rho激酶信号通路与缺血性脑血管病
Rho/ Rho激酶信号通路与缺血性脑血管病
王志  曹秉振
济南军区总医院神经内科
Rho/Rho-kinase Signalling Pathways and Ischemic Cerebrovascular Disease
Wang Zhi  Cao Bing-Zheng
Department of Neurology,General Hospital of Jinan Military Area of Chinese PLA
摘  要 Rho/Rho激酶信号通路是体内普通存在的一条信号通路，它通过调节细胞内肌动蛋白骨架的聚合状态而扮演着“分子开关”角色，参与多种细胞功能。Rho/Rho激酶信号通路在缺血性脑血管病的危险因素、发病机制和病理生理中发挥了重要作用，抑制Rho/Rho激酶信号通路取得了显著的神经保护作用。
关键词: Rho，Rho激酶，缺血性脑血管病，脑损伤，内皮..
ABSTRACT  Rho/Rho-kinase are ubiquitously expressed proteins that as molecular switches in intracelluar singal transduction pathways with changes in cell actin cytoskeleton. Rho/Rho-kinase signalling pathways coordinate diverse cellular functions, including cell polarity, cell adhesion and migration,cell proliferation and apoptosis,genetic transcription, smooth muscle cell contraction. Rho/Rho-kinase pathway plays an important role in ischemic cerebrovascular disease,not only in risk factors,such as chronic hypertension, artherosclerosis,diatetes and aging, but also in pathogenesis and pathophysiolocal condition. Inhibition of Rho/Rho-kinase signalling pathways leads to significant neuroprotective effect. Rho/Rho-kinase may be an important therapeutic target for ischemic cerebrovascular disease.
Key words: Rho, Rho-kinase, ischemic cerebrovascular disease, brain injury, endothelium.
Rho/Rho激酶信号通路是体内普通存在的一条信号转导通路，它通过调节细胞肌动蛋白骨架的聚合状态，参与调控了细胞形态维持、细胞粘附与迁移、细胞增殖落与凋亡、基因转录、平滑肌收缩[1、2]等多种生物学行为，介导了多种平滑肌与非平滑肌功能异常相关疾病的发生机制，是近年来研究的热点之一。本文就该信号通路的生物学特征及其与缺血性脑血管病的关系作一综述。
一、Rho/Rho激酶信号通路的生物学特征
1、Rho 即Ras homologue，Ras同源物，于1985年在研究雨虎的Ras相关基因中获得[3]。Rho为一种分子量为20-30kD的小分子鸟苷酸结合蛋白，是Ras超家族成员之一，因具有GTP酶活性，又称为Rho GTP酶(Rho guanosine triphosphatases,Rho GTPases)，是目前研究最为清楚的Ras相关单体GTP酶。人类Rho家族由23个基因位点组成，至少可以编码26种不同的蛋白，并可以分为六个亚家族[4](表1)。
表1、Rho蛋白家族的分类与亚型
分  类
亚  型
Rho
RhoA,  RhoB,  RhoC
Rac
Rac1,  Rac2,  Rac3,  RhoG/AhrG
Cdc42
AhoJ/TCL,  AhoQ/TC10,  Cdc42/G25K,
RhoU/Wrch1,  Rhov/Wrch2
Rnd
Rnd1/Rho6,  Rnd2/Rho7,  Rnd3/RhoE,
RndD/AhrD,  RhoF/Rif
RhoBTB
RhoT/Miro
RhoBTB1, RhoBTB2, RhoBTB3, RhoH/TTF,
RhoT1/Miro1,  RhoT2/Miro2
像Ras超家族大多数成员一样，RhoGTP蛋白也存在GDP、GTP两种结合形式，在失活与激活状态之间转化而扮演着“分子开关”的角色。有三种调节蛋白控制这个过程：GEFs、GAPs和GDIs。GEFs(Guanosine nucleotide exchange factors,鸟苷酸交换因子)促进GDP形式转变为GTP形式，产生活性形式。GAPs（GTPase activating proteins GTP酶活化蛋白）促进GTP结合分子的水解，而转化为非活性状态。GDIs(GDP association inhibitors GDP解离抑制因子)抑制了Rho与GDP的解离，维持非激活状态[4、5]。
2、Rho激酶  又称Rho相关激酶（Rho associated kinase）、ROCK（Rho associated coiled-coil forming protein kinase,Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶）。属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，于1996年被发现，分子量约160kD，在哺乳动物细胞中，ROCK包括2种亚型：ROCK1和 ROCK2。ROCK1又称ROCKⅠ、ROCKβ、ROKβ，ROCK2又称ROCKⅡ、ROCKα、ROKα[6-8]。ROCK序列包括一个N末端激酶区（催化区），一个包括Rho结合区（Rho-binding domain RBD）的卷曲螺旋区域，和C末端的PH（pleckstrin-homology）区。ROCK1和 ROCK2两个亚型在氨基酸序列上有65%同源性，在RBD有58%同源性，激酶区则为92%[8]。
Rho激酶在体内广泛表达，其中ROCK2主要在脑、心脏和骨骼肌表达，ROCK1在心脏、肺、肝、脾、胰、肾、胎盘等组织广泛表达[8-11]。Hashimoto R等对牛的大脑研究发现，在海马的锥体神经元、大脑皮质、小脑的蒲肯野氏细胞中Rho激酶的活性较强[12]。免疫组化染色发现Rho激酶主要分布在细胞胞浆中，被激活后转移至胞膜上[7、13]。
3、Rho/Rho激酶信号通路的激活
Rho在多种生理病理进程中被激活，激活途径主要有两种，一是通过异源三聚体G蛋白耦联受体（G protein coupled receprot,GPCR）、酪氨酸激酶受体及细胞因子受体的活化，二是通过细胞粘附及整合素的激活[14]，并在GEFs、GAPs和GDI的调节下完成的。而Rho的下游靶效应分子现已证明有70多个[4]，Rho激酶是其最主要的最直接的效应分子。
Rho激酶本身可以被Rho、鞘氨醇磷脂酰胆碱（sphingosylphorylcholine, SPC）、花生四烯酸、蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）[15]等多个上游分子所活化，而Rho是其最主要最直接的上游刺激信号。Rho激酶的下游靶分子包括肌球蛋白轻链磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）、肌球蛋白、ERM家族蛋白、内收蛋白及LIM激酶等约二十余种[16]。
MLCP是第一个被确定的Rho激酶的底物，也是最主要的底物。活化的ROCK对MLCP的肌动蛋白结合亚基（myosin-binding subunit,MBS）肽链的Thr697、Ser854、和Thr855进行磷酸化修饰，使MLCP失活，失活的MLCP不能将肌动蛋白轻链（myosin light chain，MLC）脱磷酸化，磷酸化的MLC水平增高，肌动—肌球蛋白交联增加，从而导致肌动蛋白微丝骨架的收缩与聚合[16]，此外Rho激酶还能直接磷酸化肌球蛋白及提高细胞对钙的敏感性而增强收缩。而细胞的移动、趋化、粘附、收缩及凋亡等都与微丝骨架的聚合与延伸有关， Rho/Rho激酶信号通路就是通过样一个复杂的磷酸化与脱磷酸化的信号级联放大过程来控制细胞生物学行为，产生细胞应答，涉及细胞支架变化、微管动力、囊泡运输、细胞极性和细胞周期等，在平滑肌细胞表现为平滑肌收缩[1]，同样在疾病的发生发展中这些途径也被激活[17]。
二、Rho/Rho激酶信号通路与缺血性脑血管病
缺血性脑血管病的危险因素有高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、年龄等，缺血再灌注后的内皮功能障碍、炎症介质、细胞因子等介导了脑损伤。
1、Rho/Rho激酶与高血压
高血压发病的中心环节是血管阻力增加，具体机制仍不清晰。血管紧张度一个主要的决定因素是血管平滑肌内的肌球蛋白轻链磷酸化程度。Rho/Rho激酶通过抑制肌球蛋白轻链磷酸化酶提高肌球蛋白轻链磷酸化水平而增加血管紧张度。已有证据表明Rho/Rho激酶介导的平滑肌收缩、血管紧张度增高是高血压的发病机制之一[18]。在各种高血压模型动物的血管内Rho/ROCK表达增高，应用Rho激酶抑制剂法舒地尔或Y-27632能不同程度地降低血压，扩张血管[19]。研究还发现，在自发性高血压大鼠4周龄血压尚正常时RhoA的表达已经增高了[19]，羟法舒地尔（法舒地尔的活性代谢物）能抑制4周龄自发高血压大鼠的激动剂诱导的肠系膜血管收缩，而对于正常大鼠却没有此作用[20]，这些证据表明，血管RhoA/ROCK的表达和活性增高可能是独立于或早于高血压发生的。
2、Rho/Rho激酶与动脉粥样硬化
动脉粥样硬化是一个包括炎症反应、内皮功能障碍、平滑肌细胞增殖、细胞外基质和血栓形成的复杂进程。已有证据表明ROCK在动脉硬化炎症中上调[21]。Shimokawa等[22]用IL-1βG刺激猪的左冠状动脉造成冠脉狭窄和动脉硬化损伤，然后给予口服法舒地尔8周，与对照组相比，实验组动脉Rho激酶活性显著降低，而且出现明显的冠状动脉粥样硬化消退和冠状动脉狭窄减轻。Mallat Z等[23]认为早期动脉粥样硬化的形成可能与ROCK参与激活NF-κB和T淋巴细胞增殖有关。
3、Rho/Rho激酶与糖尿病
已有实验研究发现糖尿病模型动物的Rho/Rho激酶活性明显增高。Miao L等[24]发现在链唑霉素诱导的Ⅰ型糖尿病模型大鼠中，相对于对照组，基底动脉的RhoA mRNA水平及膜结合型RhoA（即活性型）明显增高。在Ⅱ型糖尿病小鼠模型中，基底小动脉对于ROCK抑制剂Y-27632的扩张反应明显强于对照组，同样提示糖尿病动脉内Rho/Rho激酶的活性增高[25]。Shaohua Chang等[26]发现糖尿病兔子膀胱内ROCKβ mRNA水平是正常对照组的十倍多，而ROCKβ水平是对照组的两倍多。
4、Rho/Rho激酶与年龄
Miao L等[27]报道在成年大鼠的基底动脉，内皮和平滑肌层的RhoA mRNA表达和膜结合形式的RhoA，是随着年龄增加而增高的，其中19月龄大鼠的基底动脉RhoA mRNA水平比2月龄大鼠增加了2.4倍。Liming Jin等[28]发现，老年大鼠阴茎的膜结合型RhoA比年轻大鼠增加了95%，而代表Rho激酶活性的肌球蛋白轻链磷酸酶靶亚基（myosin light chain phosphatase target subunit, MYPT1)比年轻大鼠增加了56%，这些都强烈提示Rho/Rho激酶信号活性与年龄呈正相关。
5、Rho/Rho激酶与脑血管痉挛
脑血管痉挛多见于蛛网膜下腔出血（SAH）后，也是短暂性脑缺血发作和高血压脑病的主要发病机制。Rho/Rho激酶介导血管平滑肌收缩，是血管痉挛的重要发病机制。Sato M等[29]在狗的SAH模型中发现，基底动脉痉挛程度随Rho激酶信号通路的活化而加强，并伴随MLC和MLCP的MBS磷酸化水平的升高，应用ROCK抑制剂Y-27632后，动脉痉挛程度及MLC和MBS的磷酸化水平均能被抑制。同样的结果在兔的SAH中也观察到，应用法舒地尔后，能使增高的MLC和MBS的磷酸化水平显著降低[30]。作为最强大的内源性血管收缩剂之一的内皮素1在血管痉挛中起到重要作用，内皮素1介导的血管痉挛主要机制是增加收缩细胞的钙敏感性。Elias Q. Scherer等[31]在蜗轴螺旋动脉痉挛研究中，应用Y-27632抑制Rho激酶，能阻断内皮素1诱导的钙敏感性的增加，能预防和逆转内皮素1诱导的血管痉挛，其次应用选择性抑制MLCP的抑制剂calyculin A，比内皮素1更能显著增加钙敏感性，表明了内皮素1通过Rho/Rho激酶激活而诱导血管收缩。
6、Rho/Rho激酶与内皮功能及他汀类药物
血管内皮细胞分泌多种血管活性物质，如NO、前列环素、内皮衍生的超极化因子和内皮素等，作为重要的自分泌和旁分泌器官调节血管壁内环境稳定。内皮功能障碍以内皮衍生的NO合成、释放减少和（或）活性下降为标志。在脑缺血及再灌注损伤中，NO既有扩张血管、改善缺血区血供、抑制血小板聚集和平滑肌细胞增殖及白细胞募集等重要作用，又有产生自由基，介导和加重缺血再灌注损伤的毒性作用。适当浓度的NO对脑血流的调节有十分重要的作用，对神经元有保护作用。NO生物活性的增加有赖于内皮一氧化氮合酶（eNOS）表达的增加和活性氧簇（ROS）的减少。在培养的内皮细胞中Rho能负性调节eNOS表达[32]，进一步的活体实验发现，Rho/Rho激酶介导的eNOS上调是在其作用的肌动蛋白细胞骨架方面，而不是在下游其他信号途径；而且Rho/Rho激酶信号途径介导的eNOS表达上调并不是诱导eNOS基因转录，而是在于转录后通过延长eNOS mRNA半衰期，增加eNOS mRNA稳定性来实现的[33]。在急性脑缺血动物模型中，缺血区ROCK活性增强，内皮一氧化氮合酶（eNOS）表达明显下降，应用ROCK抑制剂法舒地尔或Y-27632能ROCK活性下降，使eNOS mRNA表达上调，eNOS活性恢复，并能使缺血面积减少，保护脑缺血，ROCK抑制剂的神经保护作用在eNOS缺乏小鼠不出现[33-35]，以上结果表明在缺血性脑卒中RhoRho激酶信号途径能负性调节eNOS表达，抑制Rho激酶信号途径产生的神经保护作用是通过上调eNOS活性来实现的。
作为3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG CoA）还原酶抑制剂的他汀类药物，不仅具有降脂作用，还具有改善内皮功能、稳定动脉粥样斑块、减少氧化应激和炎症反应、抑制血栓形成等所谓的多效性，从而在心脑血管防治中扮演着越来越重要的角色[36]。
他汀所抑制的HMG-COA还原酶，是肝内胆固醇合成的限速酶，此酶使HMG- CoA转化成3-甲-3,5-二羟戊酸。除此之外他汀还阻断类异戊二烯的合成，如焦磷酸法呢酯（farnesylpyrophosphate FPP）和焦磷酸牛龙牛儿基牛龙牛儿酯（gerany-geranyl pyrophosphate GGPP），类异戊二烯化是小G蛋白如Ras、Rho翻译后修饰和进行膜定位，发挥其活性所必需的，他汀类的多效性至少是部分通过抑制小G蛋白如Rho实现的[37]。实验证实他汀能负性调节Rho活性，抑制细胞骨架改变，稳定eNOS mRNA，增加eNOS活性，减少实验动物的脑梗死面积，而这种保护效应在eNOS缺乏小鼠不出现[33、38]。
由此可见，Rho/Rho激酶在介导脑缺血后血管内皮功能障碍中处于重要环节，Rho/Rho激酶抑制剂及他汀类均通过其影响内皮eNOS活性而发挥神经保护作用。
7、Rho/Rho激酶与缺血性脑损伤
在中枢神经系统，Rho涉及神经元形态发生、轴突和树突生长、轴突向导、树突重塑和突触生成[39、40]。Donovan FM等[41]通过激活RhoA，引起凝血酶释放，导致培养的神经元和星形胶质细胞凋亡，而且抑制RhoA可以阻止凝血酶介导的神经细胞凋亡。Trapp T等[42]在小鼠中风模型中，发现损伤的神经元内RhoB基因表达上调,海马神经元凋亡与早期RhoB增加相关，表明RhoB在脑损伤的神经信号传导中发挥重要作用。Christine Brabeck等[43]通过分析22例经病理证实的局灶性脑梗死病人发现，脑梗死1天后即有RhoA、B的表达，2-10天后显著性增高，以2-12周表达最高，4-38月后仍有表达，巨噬细胞是表达RhoA、B的主要细胞来源，其次是是活化的胶质细胞，另外多核白细胞也有微弱表达，Rho蛋白在巨噬细胞的募集及激活中发挥重要作用。Yoshiyuki Rikitake等[34]发现小鼠急性脑缺血后ROCK活性比对照组增加了两倍多，应用法舒地尔抑制ROCK使ROCK活性下降55%，使缺血面积减少33%，提高神经缺损评分37%。Yagita Y等[44]应用免疫组化染色技术，把ROCK的底物P-内收蛋白（p-adducin）磷酸化作为评价ROCK激活的指标，发现大鼠脑缺血后6小时磷酸化P-内收蛋白就在缺血区域内皮出现，在同样的区域并观察到微循环障碍和血管假性血友病因子（von Willebrand factor  vWF)染色阳性的内皮细胞的增加。应用法舒地尔后能抑制ROCK激活，改善了微循环，抑制vWF染色阳性的内皮细胞，抑制了梗塞区扩展和改善神经功能缺损，结果表明脑缺血后内皮细胞ROCK激活并参与微循环障碍。Yamashita K[45]等应用Western blotting发现永久性大脑中动脉闭塞小鼠模型纹状体内ROCK活性明显增高，免疫组化染色表达增加，特别是缺血早期轴突内更明显。国内李德渊[46]等在研究新生大鼠缺氧缺血性脑白质损伤发现，脑白质缺氧缺血后12小时RhoA mRNA开始升高，48小时达到高峰，72小时开始下降，但仍高于对照组水平，至第7天降至正常。
急性脑缺血后的炎症反应机制介导了继发的神经损伤。白细胞穿过内皮屏障转运，即穿越内皮迁移（transendothelial migration TEM）在炎症反应中处于中心位置。Rho/Rho激酶调节细胞骨架组成，介导细胞收缩和细胞粘附，因此必然涉及细胞迁移和内皮通透性，其次白细胞粘附、内皮细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）聚集、白细胞与内皮细胞间“对接”结构的形成均受Rho/Rho激酶的调节[47]。已有临床报道证实急性缺血性中风病人的多形核白细胞中ROCK活性增高，表明在侵入的炎症细胞或神经元中，RhoA/ROCK活性可能与缺血性脑损伤有关[48]。炎症反应同样损害血脑屏障，已有研究证实Rho/Rho激酶参与了血脑屏障的破坏[49]。
其次，Rho还能通过不同途径激活转录因子核因子κB（NF-κB）[23、50]，而NF-κB通过调控多种基因表达，参与了缺血后的炎症反应和神经元凋亡，在缺血性脑损伤中起到了重要作用[51]。
8、Rho激酶抑制剂的神经保护作用
抑制Rho/Rho激酶途径可以缓解脑血管痉挛、改善内皮功能、改善微循环、减轻炎症反应和抑制神经细胞凋亡。Rho激酶抑制剂法舒地尔和Y-27632的神经保护作用在大量动物实验中已经得到证实[33-35、44、52-54]。在日本，法舒地尔自1995年以来被用作治疗SAH后血管痉挛取得了显著的效果。Satoh SI等[53]证实能法舒地尔显著增加脑缺血大鼠的局部脑血流量，能显著降低全血粘滞度、改善血流动力学和预防炎症应答，而且具有广泛的治疗时间窗。一项多中心、安慰剂对照、双盲临床试验显示，急性缺血性中风48小时内，给予法舒地尔60mg 静脉注射，一天二次，应用14天，相对于对照组，法舒地尔能明显改善神经功能和临床转归，而且没有严重的副作用，表明急性缺血性中风48小时内应用法舒地尔是有效的和安全的[55]。
综上所述，Rho/Rho激酶信号通路通过调节细胞肌动蛋白骨架而参与多种细胞生物学行为，Rho/Rho激酶信号通路的异常激活在缺血性脑血管病的危险因素、发病机制和病理生理中发挥了重要作用，抑制Rho/Rho激酶信号通路取得了明显的和广泛的神经保护作用。相信在此领域更深入的研究会给缺血性脑血管病的防治带来更广阔的前景。