人源化抗体发展概略及其在医学领域的应用

　　自从抗体出现以来,许多令医生们棘手的临床疾病的治疗已不再是不可能的了。随着科学技术的发展,抗体的发展有了突飞猛进的进步。抗体的研究也步入了新的阶段,从最初的简单的抗体到鼠源化抗体,再到现如今的人源化抗体。伴随着人源化抗体的不断进步和完善,在医学领域得到了广泛应用,尽管人源化抗体的发展还是存在许许多多的障碍,但它在医学领域的应用已显示出它巨大的潜力。本文就人源化抗体近年来的发展及其应用做了简要的综述。
　　
　　1　人源化抗体的研究发展
　　
　　1. 1　人源化抗体
　　人源化抗体是在嵌合抗体的基础上进一步减少鼠源成分,及保留鼠抗体CDR 区,其余全部替换成人抗体相应部分,这种经过改型抗体,人源成分达90% ,即通常所指的人源化抗体。
　　在疾病治疗中,人源化抗体之所以优于鼠源性抗体,不仅因为抗体中鼠源性成分的减少降低了机体的免疫排斥反应,还在于人源化抗体中FC 段能够诱发机体的效应机能募集效应因子或效应细胞,后者对靶细胞具有杀伤作用[ 1 ]。人源化抗体的另一个优点是它在体内的半衰期长,鼠性抗体的半衰期不到20小时,而人源化抗体可达数天有时甚至接近21天[ 2 ]。
　　
　　1. 2　人源化抗体的发展背景　　
　　抗体是能与相应抗原结合的具有免疫功能的球蛋白[ 3 ] ,1888年Emile Roux及Alexander Yersin从白喉杆菌的培养上清液中分离可溶性毒素,后者注入动物体内可引起的白喉发病症状。Von Behring及其同事Kitasato (北里)报告,以白喉或破伤风毒素免疫动物后,其血中可产生一种中合毒素的物质,能阻止毒素引发疾病。来自实验动物的抗毒素血清用于感染的患儿,获得明显的治疗效果,尤其是在发病的早期。于是将能中和毒素的物质称为抗毒素( antitoxin) ,后引入抗体一词。
　　抗体制备技术经历了三个时代,第一代:血清多克隆抗体;第二代:鼠源单克隆抗体;第三代:基因工程抗体。随着20世纪80 年代末90 年代初噬菌体抗体库技术的建立,1997年位于美国加州的Abgenix公司使用转基因技术成功的制备出了含人免疫球蛋白基因的转基因小鼠Xenom2ouse2001年英国剑桥大学Karpas教授自人多发性骨髓瘤细胞中筛选出了一株细胞株,在体外具有稳定的扩增能力,被命名为Karpas 707H细胞,使得全人源化分子单克隆抗体的制备成为可能。
　　从20 世纪70 年代, 英国学者Milstein 和德国学者Kohler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来,单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用,单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可以用于分离、纯化特定分子抗原,甚至用于临床疾病的治疗等。然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多数鼠源性的,而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗中存在诸多问题:单克隆抗体不能有效的激活人体中补体和FC受体相关的效应系统,单克隆抗体被人体免疫系统所识别产生人抗鼠抗体(HAMA) ,在人体循环系统中被很快清除掉。因此,在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[ 4 ] 。
　　随着分子生物学研究的深入,在抗体基因工程研究领域相继出现一系列技术突破,如用PCR方法扩增抗体可变区基因,大肠杆菌表达功能性抗体片段,以及噬菌体展示功能性抗体片段等[ 5 ]。这些技术为抗体人源化的研究奠定了基础。人源化抗体的出现被誉为单克隆抗体之后,抗体研究领域的第二个里程碑,它使沉寂多年的治疗性抗体再次成为生物医药研究的热点。
　　
　　2　人源化抗体的构建
　　
　　2. 1　人源化抗体的构建方式
　　2. 1. 1　嵌合抗体
　　第一代人源化抗体是简单的嵌合抗体,即用人源基因代鼠源mAb的Fc区域[ 6 ]。这样构建的嵌合抗体即可保留抗原抗体结合的特异性,又大大降低了鼠源mAb的免疫原性,而且在构建抗体时有目的的选择抗体类型或亚型以有效发挥其效应器功能。
　　2. 1. 1　CDR移植抗体
　　由于鼠源性抗体V区中的框架区( FR)仍残留一定的免疫原性,这种抗体还远非真正的人源化抗体,有些还能产生很强的抗独特型反应,为减少鼠源成分,人们进一步用人的FR替代鼠FR,形成更为完全的人源化抗体,即除了3个互补决定区(CDR)是鼠源的外,其余全部是人源化结构,又称CDR移植抗体(CDR - grafted antibody)或改型抗体( reshapedAb) [ 7 ]。但对于特定的抗原分子来讲,框架区( FR)并不是可以随意替代的。具有支持作用的FR不仅为CDR的构象提供了环境,有时还参与抗体结合位点正确构象的形成,甚至参与抗原的结合。因此,简单的CDR移植往往降低或丧失原亲本抗体的亲和力[ 8 ]。越来越多的研究结果表明,框架区部分对于抗体CDR的三维结构的维持和整个抗体的亲和常数仍起着很大作用,故人源化抗体的亲和力总比鼠源性单克隆抗体的亲和力弱。如何在FR中、FR和CDR之间进行操作,目前主要有4种策略: ①模板替换:使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR; ②表面重塑:对鼠CDR和FR表面残基进行镶饰( veneering)或重塑( resurfacing) ,以使类似于人抗体CDR 的轮廓( p rofile) 或人FR 的型式( pat2tern) ; ③补偿变换:关键作用的残基进行改变,以补偿完全的CDR移植; ④定位保留(positional consensusmethod) :人源化mAb以人FR保守序列为模板进行人源化,但保留了鼠源mAb可变区中参与抗原结合的氨基酸残基,包括CDR和FR中的一些关键残基[ 9 ] 。
　　2. 1. 3　全人单克隆抗体制备技术
　　①噬菌体表面展示技术:制备传统的人源化抗体过程复杂,费用昂贵,大量反复的实验不可避免。随着抗体工程的发展,建立在噬菌体外壳表达抗体片段的能力的基础上的噬菌体显示技术应运而生了,即用PCR技术从生物体内扩增出整套编码人抗体的基因序列,克隆到噬菌体载体上,并以融合蛋白的形式表达到噬菌体表面,从而可以方便的利用抗原- 抗体特异性结合进行筛选、扩增[ 10 ]。也就是说,它是用细菌克隆取代B细胞克隆来表达各种抗体组份的。此项技术的建立,不仅不需要细胞融合,甚至不经过免疫动物,利用抗原直接从库中筛选出所需基因,这是人源抗体制备技术的重大突破。②转基因小鼠:抗体制备的基本方法是抗体生成过程不是从普通小鼠开始,而是从鼠源抗体生成基因被相应人基因所取代的转基因小鼠开始[ 1 ]。在以后,生产过程仍遵循Kohler等人在1975年建立的常规方法,但由于是以转基因小鼠为起点分泌的杂交瘤最终产生全人序列的抗体。此方法的优点在于:其功效优于其他生产正常人体蛋白mAb技术。小鼠识别抗原和动员该抗原的抗体系统保持完整。由于抗体是在体内产生,在体内进行正常的装配和成熟过程,从而保证抗体具有较高的靶亲和力。目前,国外已有研究人员成功地在小鼠B细胞内导入大片段DNA,并进行V(D) J重排,表达在B细胞表面,经抗原免疫后发生高突变并表现亲和力成熟和Ig类别转换,生产出全人单克隆抗体。
　　
　　2. 2　人源化抗体的表达
　　2. 2. 1　在大肠杆菌中表达
　　细菌是表达无糖基化蛋白的最理想工具,在所有细菌表达系统中,大肠杆菌表达系统被列为首选对象。但由于受其自身加工能力的限制,大肠杆菌不适合表达完整的抗体分子,大多用来选择性表达Fab或scFv等抗体片段。用大肠杆菌表达单链抗体有2种方式:一种是表达为包涵体或非包涵体的不可溶性蛋白,这种表达方式的产量较高,但须进行复杂的变性- 复性过程,使其完成正确的空间结构折叠,恢复抗体活性;另一种是分泌表达,将细菌的信号肽与单链抗体的氨基端连接起来,细菌的信号肽可使单链抗体分子分泌到细菌的周质腔内,此时信号肽被信号肽酶切除,单链抗体分子在具有氧化环境的周质腔内完成二硫键的形成和肽链折叠,形成有活性的抗体分子,但产量较低[ 8 ]。单链抗体在大肠杆菌中的表达对启动子无特殊要求。在分泌型表达时,需要有适当的信号肽序列,有适当的内切酶位点来拼接单抗基因[ 11 ] 。
　　2. 2. 2　在酵母中表达
　　自20世纪80年代初Hitizeman等首次运用酿酒酵母表达了人干扰素基因以来,运用酵母这种单细胞真核生物表达外源基因越来越受到重视,已建成了多种基因表达系统,表达出了多种蛋白质。巴斯德毕赤酵母表达系统已被证明是既可以用于分泌表达又可以用于细胞内表达外源基因的一个理想的酵母表达系统,它具有强启动子AOX1、完善的分子生物学操作方法、成熟的高密度发酵技术,已成为生产商业化蛋白的重要表达系统之一。利用强启动子AOX1已经高效表达了多种外源基因,如肿瘤坏死因子、人血清白蛋白、蛋白酶抑制因子等都超过1 g/L的表达水平,其中肿瘤坏死因子和破伤风毒素C片段的表达水平达10 g/L以上。多形汉逊酵母是又一个成功的酵母表达系统,已用于表达乙型肝炎表面抗原等用它可以开发一种新的低廉的乙肝疫苗[ 12 ]。
　　2. 2. 3　在昆虫细胞中表达
　　杆状病毒介导的表达系统是目前应用最广泛的昆虫表达系统。杆状病毒为环状双链DNA病毒,具有严格的宿主专一性。以含多角体蛋白基因启动子的杆状病毒为载体的外源DNA,能在感染后的昆虫细胞培养基中高效表达。昆虫细胞表达重组抗体有许多优点,如能进行翻译后修饰,抗体的活性较稳定、产量高、适用性强。近年来的研究成果显示,杆状病毒表达系统非常适合生产用于临床诊断甚至治疗的抗体片段和完整的抗体[ 8 ]。
　　2. 2. 4　在哺乳动物细胞中表达
　　与原核细胞、酵母、细菌及昆虫细胞相比,以哺乳动物培养细胞作为宿主细胞,表达的蛋白最接近其天然构象,因而哺乳动物细胞表达系统成为生物工程制药较为理想的表达系统。在使用哺乳动物培养细胞表达抗体时,在蛋白合成起始信号、加工、分泌糖基化方面具有独特的优势,因此,大多数研究者都采用哺乳动物细胞进行重组抗体的表达。最基本的真核表达组件包含可转录外源DNA序列的启动子元件和转录产物有效地加上p loy(A)所必需的信号,另外一些附加元件包括增强子及带有剪接供体和剪接受体功能位点的内含子。常用的表达载体有pSV2 - gp t和pSVneo,因其带有选择标记基因( gp t, neo) ,可以筛选到稳定表达人源化抗体的克隆,并通过加工筛选,使其表达量有较大的提高。许多研究结果显示[ 8 ] , COS细胞是短暂高效表达人源化抗体较为理想的细胞,一般在几天内即可以装配成功,避免花费不必要的时间去构建稳定的细胞系,从而为快速分析抗体提供了可能。
　　
　　3　人源化抗体在医学领域的应用
　　
　　3. 1　医学诊断
　　3. 1. 1　实验诊断
　　抗体是实验诊断学领域用途最为广泛的蛋白分子。噬菌体抗体完全可以代替动物源性抗体,应用于免疫学诊断。此外还可以通过融合表达方式,直接生产抗体- 酶,抗体-荧光蛋白,抗体- 生物素等标记抗体,避免了化学标记对抗体活性的损伤[ 10 ]。
　　3. 1. 2　肿瘤放射免疫显像诊断
　　放射性核素(125 I、99Tcm、131 I)与抗肿瘤抗体的偶联物在体内能将前者运至药靶部位,并通过放射免疫显像技术用于体内肿瘤定位诊断。双特异性抗体(BsAb)为放射免疫显像提供了一种更为有效的手段,可减轻药物对机体的损伤,并增加放射免疫显像的清晰度和灵敏度[ 10 ]。
　　
　　3. 2　疾病治疗
　　3. 2. 1　作用机制
　　特异性抗体在病毒感染早期和从感染靶细胞释放出病毒时期是重要的防御屏障,因为在此期间,病毒处于细胞之外,抗体可与之结合,抗体主要通过下列途径发挥作用[ 11 ] 。①中和:与病原体的表面抗原相结合,阻止它们进入易感细胞和组织。②调理作用:与病毒结合后,可促进吞噬细胞对病毒颗粒的吞噬作用。③补体激活:通过抗原- 抗体复合物或病原体- 抗体复合物激活补体诱导炎症反应,并吸引吞噬细胞进入感染位点;另一方面,通过经典途径和旁路激活途径形成攻膜复合体,最终导致感染细胞的裂解。④抗体依赖性的细胞介导的溶细胞效应(ADCC) :单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞通过其表面分子FcγR与抗体分子的Fc段相结合,从而结合在感染细胞的表面,发挥杀伤作用。
　　3. 2. 2　人源化抗体在一些病毒性疾病治疗中的研究进展
　　①急性呼吸系统综合征( SARS)相关冠状病毒:在SARS流行期间,香港和北京的某些医师用恢复期病人的血清治疗重症患者,获得了较好疗效,提示抗SARS人源抗体可用于SARS感染的被动免疫治疗。Sun J ianhua等构建大库容的单链抗体( ScFv)噬菌体抗体库,用SARS相关的冠状病毒S1蛋白进行筛选,获得了具有中和活性的抗SARS相关冠状病毒S1蛋白人源抗体80R,可竞争性地阻止S蛋白与其受体血管紧张肽转移酶(ACE2)相结合,并且体外实验中可有效中和SARS病毒的活性。中和性位点分析结果表明它所识别的位点位于S蛋白N端261 - 672aa之间。这对于SARS病毒疫苗和被动性免疫预防制剂的研制均具有重要意义[ 13 ]。②免疫缺陷病毒(H IV) :动物实验表明,在H IV感染早期,抗H IV中和性的单克隆抗体对于病毒的清除和阻止其进一步侵袭组织发挥重要作用。对H IV中和抗体的研制无论是嵌合抗体还是人源抗体均有很多报道。Major JG等将抗H IV gp120 C4区域的鼠源单克隆抗体G3 - 519进行人源化改造,使其重链和轻链恒定区分别用人抗体γ1链和κ链恒定区取代,在体外试验中嵌合抗体保持了鼠源抗体相似的结合活性和中和活性。Ewa Bjorling等利用噬菌体表面展示技术构建抗H IV - 2型Fab段抗体噬菌体抗体库,筛选出了抗H IV - 2包膜糖蛋白gp125的Fab段抗体,在体外实验中显示出了对H IV - 2较好的中和活性[ 11 ]。③呼吸道合胞病毒(RSV) : RSV易引起婴儿呼吸道疾病,如细支气管炎和肺炎,并可诱发其他一些严重疾病,目前已有人源化单克隆抗体Palivizumab经美国FDA 批准上市。它为鼠单抗1129用基因工程手段人源化,将鼠源单抗1129的CDR区6个氨基酸移植入人单抗IgG框架区内所得。临床实验证实无毒、副反应,并可显著降低婴儿的住院率[ 10 ]。④埃博拉病毒:埃博拉病毒可引起埃博拉出血热,具有非常强的致病性和高致死率,而且病毒感染后激发的中和反应很弱,这为中和性抗体的研究带来了一定难度。ParrenP。W。H。I。等利用杂交瘤方法研制的人源抗体KZ52,以几内亚猪作为动物模型,致死剂量埃博拉病毒攻击1h后,静脉注射抗体KZ52,在50mg/kg的使用剂量下,与不进行抗体注射的对照组相比,显著降低了试验组几内亚猪的出血热症状和血液中的病毒滴度,并可保护试验组6只中的5只免于死亡,此抗体的临床效果值得进一步研究[ 14 ]。⑤朊病毒:朊病毒( Prion)不同于一般病毒,是一种传染性蛋白质粒子,是由正常细胞蛋白PrPc构型转变为PrPSc而形成的,羊瘙痒病和牛海绵状脑病均由阮病毒引起,传染性强且给国民生产造成重大损失,近年来,有一些朊病毒抗体研究的报道,给此类疾病的治疗带来了希望。Peretz。等基于PrPc与其病理性模板PrPSc的相互作用,研制出了靶向胞内阮病毒蛋白PrPc的重组Fab段抗体D18,抑制PrPc与模板PrPSc的结合,从而抑制阮病毒蛋白PrPSc的复制[ 14 ]。其治疗效果还需进一步体内实验评价。
　　
　　4　人源化抗体的研究展望
　　
　　现在,全人抗体几乎完全转向转基因小鼠产生。为了使用更低廉的生产成本获得更大的生产能力,研究者发展了动物乳腺反应器技术,将抗体基因转移至山羊或牛的体内,特异地在乳腺中表达,表达的抗体被分泌到动物的乳汁中从而可被收集纯化了[ 15 ]。如果能更好地解决畜群的传代问题,转基因动物生产人源化抗体的技术必将得到广泛的应用,极有可能代替动物细胞培养,成为大规模生产人源化抗体药物的常规技术。在医学领域将会有更大的应用前景,为当今疑难疾病的治疗提供了新的方法和技术。

　　
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