1.bowtie:短序列比对的新工具（转）

1.Bowtie是一个超级快速的，较为节省内存的短序列拼接至模板基因组的工具。它在拼接35碱基长度的序列时，可以达到每小时2.5亿次的拼接速度。

Bowtie并不是一个简单的拼接工具，它不同于Blast等。它适合的工作是将小序列比对至大基因组上去。它最长能读取1024个碱基的片段。换言之，bowtie非常适合下一代测序技术。

在使用bowtie前，需要使用bowtie-build来构建比对模板。如果你需要比对是比较常见的基因组的话，你可以去http://bowtie-bio.sourceforge.net/manual.shtml下载你所需要的Pre-built indexes文件就可以了。

如果bowtie在你的机器上运行起来很慢，那么你可以试试以下的一些办法来让它跑得快一些：

1. 尽可能的使用64位bowtie。很显然，64位运算会比32位运算更快。所以最好使用支持64位运算的计算机来运行64位的bowtie。如果你是从原文件开始编译程序，在g++编译时，你需要传递-m64参数，你也可以在make的时候加入这一信息，比如说传递BITS=64给make，具体的：make BITS=64 bowtie。想知道你自己运算的是什么版本的bowtie，你可以运行bowtie –version
2. 如果你的计算机有多个CPU或者CPU内核，那么请使用-p参数。-p参数会让bowtie进入多线程模式。每一个线程都会使用单独的CPU或者CPU内核。这种并行的运算模式也会大大加快运算速度。
3. 如果你的报告文件中每条短序列都有太多的匹配位点（超过10）那么你可以试着重新使用bowtie-build加上 –offrate参数，如bowtie-build –offrate 4。-o/–offrate默认值为5，每下降1，比对速度会增加1倍，但是系统消耗（硬盘空间和内存）也会加倍。
4. 如果你的系统配置太低，比如内存不足4GB，那么建议你在bowtie的时候使用–offrate参数。与上一条相反的，你需要加大offrate的值。bowtie –offrate 6. 其默认值为5。每增加1，内存空间的要求下降，这样会减少读取硬盘当中虚拟内存的次数，速度反而会有所上升。

-n模式与-v模式。

默认的，bowtie采用了和Maq一样的质量控制策略，设置 -n 2 -l 28 -e 70。总的来说，比对模式分为两种，一种是 -n 模式， 一种是 -v 模式，而且这两种模式是不能同时使用的。bowtie默认使用-n模式。

-n模式参数： -n N -l L -e E

其中Ｎ，Ｌ，Ｅ都为整数。-n N 代表在高保真区内错配不能超过Ｎ个，可以是0?3，一般的设置为2。-l L代表序列高保真区的长度，最短不能少于5，对于短序列长度为32的，设置为28就很不错。-e E代表在错配位点Phred quality值不能超过E，默认值为40。Phred quality值的计算式为：-10 log(P,base(10))

而-v模式的参数相对较少。

-v模式参数：-v V

其中V为整数。-v V代表全长错配不能超过Ｖ个，可以是0?3。这时，不考虑是否高保真区，也不考虑Phred quality值。

–best 与–strata

–best参数代表报告文件中，每个短序列的匹配结果将按匹配质量由高到低排序。–strata参数必须与–best参数一起使用，其作用是只报告质量最高的那部分。所谓质量高低，其实就是指错配的碱基数，如果指定了-l L参数，那就是在高保真区内的错配数，否则就是全序列的错配数。如果你还指定了 -M X的话，那就会在质量最高的当中，随机选择X个来报告。也就是说，当我们指定了-M 1 –best –strata的话，那就只报告1个最好的。

对于输入，-q是指输入的文件为FASTQ(文件扩展名通常为.fq或者.fastq)格式；-f是指输入文件为FASTA(文件扩展名通常为.fa, .mfa或者.fna)格式；-c是指在命令行直接输入要比对的序列。

下面就是一个具体的例子：

bowtie -v 2 -M 1 –best –strata Genomes/hg19_ebwt/hg19 Pol2ChIP.fastq Pol2ChIP.map

2.本人用过的短序列比对工具里，感觉bowtie最好使，大体用法和blast挺像的，也很简单，就两步：
第一步，build：感觉和blast的第一步formatdb差不多，在命令行输入bowtie-build
第二步，align：和blast的核心（blastall）差不多，在命令行输入：bowtie [options]*

bowtie的速度比Maq和SOAP都快，PC机上也能胜任大规模数据分析，一般100M大小的基因组做mapping，2-3min就可以了，快的让我不敢接受，呵呵，bwt算法就是牛！

bowtie的用途不仅仅是短序列比对最mapping，更多信息请参考：
http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml

3. Bowtie aligner 簡介

使用說明

本軟體目前安裝於BIP2(140.123.126.234)主機, 實驗帳號為Bioinfo　若有需要利用此軟體進行實驗, 請與　冠宏/盈達　聯絡索取實驗帳號資料

軟體目錄目標路徑: /home/bioinfo/alignmentTool/bowtie-0.12.3

Getting started

1. Building a new index
2. Performing alignments
3. Finding variations with SAMtools

準備資料

1. Reference genome data (*.fa)
2. NGS Short reads data (*.fastq)

Building a new index

• 根據 reference genome data(e.g. reference.fa) 建立 Index File

# bowtie-build [options]*  

Performing alignments

• NGS short reads data (e.g. leftRead.fastq / rightRead.fastq)
• refernece genome data(e.g. reference.fa)

# bowtie [options]*  {-1  -2  | --12  | } []

• Solid data for single-read alignment

# bowtie -S -a -f -C -p 7   -Q  >     -S     :輸出為sam檔  -a     :把所有對到的read列出來，即使有multiple mapping  -C     :input為.csfasta  -Q     :.csfasta 內容裡無 quality value，所以需準備 .qual  -f     :伴隨 -Q -C 參數  -p int :用幾顆cpu跑

• If bowtie Paired end 100% failed to align

> http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=6522

Finding variations with SAMtools

• 輸出sam格式

# bowtie -S e_coli reads/e_coli_10000snp.fq ec_snp.sam

• 轉成bam格式

# samtools view -bS -o ec_snp.bam ec_snp.sam

• 排序bam資料

# samtools sort ec_snp.bam ec_snp.sorted

• 結合bam資料

# samtools merge | …

• 找尋SNP

# samtools pileup -cv -f genomes/NC_008253.fna ec_snp.sorted.bam