不可遗忘 英剧在线:基因文库
来源:百度文库 编辑:偶看新闻 时间:2024/05/06 08:07:06
基因文库与基因库的概念不同。基因库是指某一生物群体中的全部基因。基因文库与基因克隆的概念也有区别,基因克隆是只包含某些特定基因或 DNA片段的克隆。基因文库中包含着为数众多的克隆,建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。
基因文库的建立和使用是70年代早期重组DNA技术的一个发展。人们为了分离基因,特别是分离真核生物的基因,从1974年起相继建立了大肠杆菌、酵母菌、果蝇、鸡、兔、小鼠、人、大豆等生物以及一些生物的线粒体和叶绿体 DNA的基因文库。基因文库的建立使分子遗传学和遗传工程的研究进入了一个新时期。
基因文库的建立 存量
基因载体通常根据待克隆的 DNA片段长度来选择。在制作原核生物基因文库时,因基因组较小,可把 DNA片段切得短些,可选用质粒如pBR322等作载体。真核生物的基因内部常有称为内含子的非编码区,使一个天然基因的长度比实际编码的部分要长得多,基因文库中待克隆的 DNA片段便应长些,以保证得到完整的基因。通常采用的载体有经过改建的噬菌体如λCharon4A(长度462kb,可克隆外源DNA长度 8.2~22.2kb)和粘性质粒(例如pHC79,长度6.4kb,可容纳外源DNA长度37~50kb)等。
经剪切得到的 DNA片段可通过噬菌体T4连接酶或大肠杆菌连接酶与载体DNA共价连接,使成为杂种DNA分子。
用质粒作为载体的重组 DNA分子可以通过转化引进细胞。用λ噬菌体的 DNA作载体的重组分子直接经转染引入细胞的效率较低;一般需先行离体包装,即把重组DNA分子包在噬菌体外壳中,再通过噬菌体感染而把重组DNA 分子引入敏感细菌细胞中。它的效率比转染高出几十到几百倍。
基因文库的保存和利用
从基因文库中筛选某一克隆的常用办法是分子杂交。首先把属于一个文库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养皿上以取得相当分散的菌落或噬菌斑,然后用硝酸纤维滤膜吸印,使培养皿和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。同时另行制备供分子杂交用的探针。为了筛选真核生物的某种基因,常从它的转录产物mRNA经反向转录(见中心法则)合成相应的互补 DNA(cDNA),再加入用32P标记的核苷三磷酸,用DNA多聚酶I切口移位方法制成有同位素标记的探针。把探针 DNA和硝酸纤维滤膜上的菌落或噬菌体分别进行变性处理,然后进行分子杂交。再将 X光底片覆盖在经过处理的滤膜上以进行放射自显影。在培养皿上找出和 X光底片上的黑点相对应的菌落或噬菌斑,这些菌落或噬菌体中便包含着所需要的基因。经过扩增便能得到大量的细菌或噬菌体,从中可以分离出所需基因的DNA片段。
应用与前景 建立和使用基因文库是分离基因,特别是分离高等真核生物基因的有效手段。如果一个哺乳动物的基因组是 3×109碱基对,直接从细胞中提取并分离出某一特定基因的 DNA片段在技术上是很困难的。但是在基因文库中,不同的 DNA片段都分别在不同的克隆中扩增了,只要有该基因的探针存在,则从许多克隆中筛选一个所需的克隆是一项比较简单的工作。此外基因文库中被克隆的 DNA都是基因组中各种随机的顺序片段,某些 DNA片段还包括基因外部的邻近的甚至互相跨叠的序列,所以基因文库特别有利于研究天然状态下基因的顺序组织。例如曾从人的基因文库中分离得到含有血红蛋白 β链基因的克隆,从中取得该基因的DNA并进行分析,发现人的δ和β链基因是连锁的,二者之间相隔几千个碱基对,而且在它们内部都有两个内含子。
基因文库还可以应用在个体发育的研究中。例如从芽孢杆菌的正在形成芽孢的菌体中分离mRNA,并用同位素标记做成探针,用这些探针可以从芽孢杆菌的基因文库中分离出只在芽孢形成过程中活动的基因,有助于对发育过程中基因调控进行研究。
基因文库也可以应用在高等生物,例如人的基因定位工作中。基因文库在生产实际中也是取得所需要的基因的一种重要方法。
基因文库有关技术的建立及应用虽然只有几年历史,但是它作为重组DNA技术应用的一个重要方面已经显示了它在解决分子遗传学中的理论问题和遗传工程中的实际问题上的巨大潜力。