• DNA重组实验常见问题分析

 

载体用NotI单酶切，目的片段也用NotI单酶切，并对载体进行去磷酸化，但一直也没连上？
参考见解：
1、 用NEB的高效连接酶连看看，用400U或2000U的试试
2、 16度过夜连接，或更长
3、 单酶切用PCR来鉴定方向方便些
4、 去磷酸化后，将去磷酸化酶失活很重要，否则可能根本连不上。
5、 失活的方法很多了，可以加热（有的热敏感酶可以），可以直接过胶回收柱子，但比较放心的方法就是跑胶回收。

PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶切8小时，同时，p UC18 同样酶切，连接片段和载体DNA酶切均用QIAGEN quick spin column回收片段，按NEB 连接酶说明过夜连接，连接产物电转化。但是，看转化结果，连接产物转化的平板大部分是蓝斑？什么原因？
参考见解:
1、 柱子回收一般没有问题，但会不会存在操作问题，所以回收产物可以跑胶或用紫外分光系统检测一下有没有DNA。
2、 PCR产物直接酶切，在设计引物的时候有没有在酶切位点两边加保护碱基？这里pcr产物酶切出问题的可能性很大。
3、 酶有没有问题？可以用这两个酶切一些已知的质粒看看能不能得到所要的片断。
4、 大部分是蓝斑说明可能是载体酶切不完全，也可能是没有在载体酶切后跑胶回收载体，这样不能完全除去酶切掉的小片断（Qiagen的柱子对小片断的回收比较好），后来连接反应中小片断可能又连上了。
5、 大部分是蓝斑，那就是还有白色的。挑了白色的摇了提质粒看看啊，说不定就有阳性的。
6、 建议在载体酶切后用碱性磷酸酶进行去磷酸化，这样可以彻底防止载体的自身环化。

酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭活限制酶(用的是Hind3/EcoR1双酶切),多高温度适合啊?
参考见解：
1、 一般直接用2倍体积的无水乙醇沉淀目的片段，干燥后直接用水溶解连接即可。比较适用于载体和PCR产物的连接。效果很好。
2、 酶切后要胶回收后再连接,另外酶切结束后,直接电泳回收不用加终止液,对连接没有影响.
3、 有的公司的限制酶（如NEB）是不需要热灭活的，而有的公司的限制酶（如MBI）则需要热灭活，一帮是65摄氏度，10分钟。然后经凝胶回收后再作连接，目的片段与质粒的摩尔比在3～10：1的范围内连接效果都不错。
4、 通常随酶附送的loading buffer是含有SDS起到灭活的作用，但在上样时会产生很多泡沫。

一个质粒的双酶切，两种酶buffer一样，同时切胶。跑胶时，一个小片段看不到，大概600bp，怎么办？根据Marker把需要的4900bp的片段进行胶回收，效果特别差。用乙醇沉淀法回收，然后跑胶，回收，效果也不好。现在要做连接，可双酶切后质粒的回收不好，用于连接的质粒双酶切后怎么处理？把乙醇沉淀回收的双酶切质粒直接用于连接，这样可以吗？
参考见解：
1、 做双酶切的时候用的buffer都是根据公司提供的双酶切最适buffer，每个公司应该都提供双酶切使用的buffer列表。
2、 酶切后电泳条带比较好，切胶回收的效果不好，可能是回收过程中操作出现问题，或者是回收试剂盒有问题。可以尝试更换试剂盒做回收试试，或者看看酶切电泳后目的条带有没有弥散，如果有，切胶回收得不到好的效果。
3、 用于连接的的片段应是单一的，如果将双酶切的质粒直接用于连接，即使得到了转化子，鉴定也比较麻烦，自己都不知道连上的到底是目的片段还是非目的片断。最好用回收产物做连接。
4、 酶切时如果质粒很大>7kb那么希望得到的600bp亮度相对vector太暗了，可能看不到，如果600的带看不到，可以试试加大酶切的质粒的量。相同mol数600 和 4900的带亮度差别会很大。
5、 如果酶没有问题那就要确定双酶切是否已经切开了，已经切开了，只是600bp比较弱的话，可以尝试加大酶切体系（如增大酶切体系为原来的两倍或三倍），酶切后乙醇沉淀富集酶切片断后用小体积TE溶解后电泳，效果可能有所改善。如果根本就没有切开的话，那就要考虑是否是酶的问题，buffer的问题或质粒的问题。

将载体和目的片段（PCR扩增产物，约500bp,两端设有酶切位点）分别用EcoR1和BamH1双酶切后，定向连接。但载体上该双酶切位点间有一个800bp的片段，酶切后电泳可见这一片段，表明酶切成功，胶回收了大片段。连接转化成功后，挑选的单菌落提质粒，PCR鉴定表明有目的片段，约500bp，但双酶切却仍然是800bp的原片段长度。目的片段不含有双酶切位点。请问连接是否成功？若成功了，为何会出现这种奇怪的现象？
参考见解：如果pCR没有污染
1、 假设挑选的是单菌落，则有可能是因为自己引物非特异扩增。PCR比酶切更易出问题，相信酶切结果，没连上。
2、 假如PCR没有问题，最可能是菌被污染，连上了，但有污染。这种可能性大。假阳性产生的可能性极大。
3、 最好重新挑科隆，摇菌。如果不行再用通用引物确定是否没有连上。
4、 应该使用载体引物来作PCR鉴定，因为自己的引物作很有可能出现假阳性。
5、 片断是500bp的，而载体切下来的片断中含有800bp，是否是因为重组质粒的浓度太低，使得800bp的片断可以见到，而没有办法看见500bp的，所以建议将重组质粒酶切量增加，电泳时上样量增加。
6、 可以看到800bp的片断，应该是载体自连接，因为插入片断后载体的酶切位点移位，应该没有办法再次切下800bp的片断，所以建议重新挑菌再作。
7、 如果您能通过PCR检测出您提取的质粒中含有目的片断,而双酶切时却只能显示应该切除的片断,说明可能出现的情况是:您的连接成功,但是您挑取的菌落并不是单克隆,而是包含有假阳性(也就是自连接的质粒菌落)的混合菌落,而且假阳性菌落比例高于需要的阳性菌落,导致在进行摇菌扩增质粒时,同时大量扩增了假阳性质粒,从而出现上面描述的情况.
8、 如果打算从新开始酶切,连接,转化的话,建议加大酶切时酶的使用量，在酶切片断回收时尽量不要切下杂带，这样可以尽量减少自连假阳性的可能性。
9、 如果不打算从新做过，建议在原来已经铺好细菌的LB固体培养基上，再挑取一些菌落，可以一次性多挑几个单克隆（记住，一定要是单克隆，否则很难处理），中心的和周边的，大的和小的，都挑一些，然后用国产质粒提取试剂盒进行小量提取，并且酶切鉴定，这样可以节省大量的时间，并且取的不错的效果，在用试剂盒提取之前每个菌落保留1~2ml菌液，冻存，并标记好对应的试管，如果之后发现那个菌落是阳性克隆的话，回过头来就可以使用冻存的菌液大量提取了。