偶看新闻霸州人才网官网:寡糖研究新进展
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/05/03 03:40:56
寡糖(oligosaccharides) ,亦称低聚糖,由2～9个单糖单元经苷键结合而成。根据结合的单糖个数,可分为双糖、三糖、四糖直至九糖,分子式为(C6H10O5 ) n , n = 2～9。许多寡糖及其糖缀合物因独特的结构而成为重要的生命物质,如乳果糖、大豆低聚糖、异麦芽糖等不仅以其缀合物起作用,而且其本身具有重要的生理功能,可作为促双歧杆菌生长因子,有拮抗机体过氧化损伤及降脂作用。目前,我国功能性寡糖的研发尚处于起始阶段,对一些功能显著、市场前景好、附加值高的寡糖产品的研发相对滞后。人们对寡糖在食品、医药及农业方面的开发寄予厚望。
1 寡糖的分类
寡糖类组分多以游离状态存在于植物体和果实中。构成寡糖的单糖主要是葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等五碳糖和六碳糖。
根据寡糖的单糖组成可分为同寡糖和杂寡糖,前者由同类单糖组成,后者由不同单糖组成;根据分子中是否存在游离的半缩醛羟基,还可分为还原性寡糖和非还原性寡糖,前者为糖基2糖基2糖的形式,后者为糖基2糖基2糖苷的形式;根据生物学功能可分为普通寡糖和功能性寡糖,前者可被机体消化吸收,产生能量,如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽寡糖等,后者具有特殊的生理学功能但不被肠道吸收。还有一类寡糖是在侧链上修饰不同的化学基团,如胺基、羟基、硫酸基等,此类产物有糖醛酸、胺基糖、脱氧糖等。
2 寡糖的提取与制备
目前主要有从天然产物直接提取、酶催化合成或酶解天然多糖、酸水解天然多糖和化学合成等4种途径。
2. 1 天然产物直接提取
从天然原料中提取未衍生化的寡糖产品十分困难。目前适用此法的寡糖有棉籽糖(从甜菜提取) 、大豆寡糖(从大豆乳清提取) 、黑曲霉寡糖(从菌体提取)等。近年此法不断取得进展。武卫红用不同体积的75 %乙醇室温提取鲜地黄中的总寡糖。Kotiguda等用70 %乙醇室温浸泡菜豆, 130 r/min摇床提取13 h,用薄层色谱和纸色谱在提取液中检测到筋骨草糖(六糖) 。
2. 2 化学合成
最常用的糖苷键合成法是1901年由Koenigs等建立的,由于氯代或溴代异头碳稳定性差,故反应产率低,立体选择性差。此法的改进以异头碳氟代物作为糖基供体最为成功。1980年Schmidt建立的三氯乙酰亚氨酰法是现代寡糖合成的首选方法。
近年,以硫代异头碳作为合成糖苷键的糖基供体是另一种较常用的方法,这些硫代基团包括硫醚、各种硫酚醚、氢硫基硫代基、砜、亚砜以及硫羟酸、硫代羟酸等。
2. 3 酶催化反应合成或酶解天然多糖
酶催化反应立体特异性强,对反应底物、糖苷键的类型及位置等均有特定要求。用于寡糖合成的酶包括糖基转移酶、糖苷水解酶及磷酸化酶等3 大类。合成原料主要有淀粉类、蔗糖、乳糖等。卢丽丽等介绍了获得和筛选各种糖苷合成酶及其合成反应机制,为寡糖的工业化生产提供了新的选择。天然多糖在自然界分布广泛。植物体就是多糖的天然储藏库,而微生物的细胞壁也由多糖组成。丰富的原料来源是酶解多糖生产寡糖的最显著优势。Pastell等用α－L－阿拉伯糖苷酶和内切木聚糖酶将麦芽阿拉伯木聚糖逐步酶解成4个寡糖。Roncal等比较了用纤维素酶、胃蛋白酶和脂肪酶A以及壳多糖酶酶解壳多糖得到壳寡糖,探索了胃蛋白酶酶解获得高产率壳寡糖的反应条件。
2. 4 酸水解天然多糖
酸水解法由于产物成分复杂,目的寡糖产率低下,不易得到高活性寡糖而未被推广应用。但是,用于某些研究中得到目的寡糖,例如Hu等在夹竹桃提取的多糖中用酸水解法得到
3个低聚半乳糖。
3 寡糖的分离
寡糖混合物的分离是研究的重点和难点之一,主要原因是(1)寡糖有相似的化学组成,多种可能的异构体,多种连接方式和分支形式,结构异常复杂; ( 2)寡糖分子缺乏生色团或荧光团,检测较困难,而有重要生理活性的糖缀合物中的寡糖组分可得量很小。目前可供分离的方法如下。
3. 1 活性炭柱层析
一般用活性炭与天然硅藻土等量混合的吸附柱分离寡糖。活性炭价格低廉、选择性强、吸附量大;天然硅藻土使溶液易流过。先用水洗脱单糖,继而在水中增加乙醇的浓度从而顺次洗出二糖、三糖以及更高聚合度的寡糖。此法分离容量大,适用范围广,既可用于不同聚合度寡糖的分离,又可用于混合糖、糖酸、糖醇和糖的乙酰酯、氨基低聚糖以及糖甲基醚的分离。糖样中含有的无机盐对分离没有影响,糖样溶液的浓度通常为
1 % ～10 %。近年活性炭柱层析被广泛应用, Kawazoe等用活性炭2天然硅藻土层析柱等方法从50种水果和蔬菜的提取物发酵液中分离到2个新的寡糖。但是,研究者也发现了此法的不足。唐岚等在分离生地黄低聚糖时,发现由于活性炭对糖的吸附力强,洗脱剂用量非常大,且无法将三、四糖与单双糖有效分离。因此,应根据分离样品的性质选择最合适的分离手段。
3. 2 硅胶薄层/柱层析
此法是最常用的分离手段之一。但是糖的极性强,硅胶薄层点样量一般不大于5μg,量多时色点形状变长, Rf值下降,难以分离Rf值相近的糖。用硼酸溶液或无机盐水溶液代替水调制吸附剂涂铺薄层,可显著提高样品承载量和分离效果。
3. 3 葡聚糖凝胶层析法
此法使用的固定相2凝胶具有分子筛的性质,分离多种成分时馏分按相对分子质量递减的顺序排列。以适当的溶液浸泡凝胶颗粒,充分溶胀后装柱,加样后用同一溶液洗脱。此法克服了糖在硅胶柱上吸附力太强的缺点,在规格选择合适情况时,可得到相当理想的分离效果,且洗脱剂用量少,层析时间短。郝林华等用Sephadex G250凝胶柱层析,从牛蒡根提取的糖样品中分离得到水溶性牛蒡寡糖。
3. 4 离子交换树脂柱层析
此法利用各糖分吸附力的不同达到分离目的。常使用具有某种结合型的强酸性或弱酸性阳离子树脂、强碱性或弱碱性以及大孔球型阴离子树脂。不同的洗脱条件可分离单糖混合物、单糖、双糖、三糖、四糖和五糖组成的体系,也可用于分离单糖、脱氧糖和糖衍生物的复杂样品,以及含有不同构型的吡喃苷及呋喃糖苷的混合物及其它糖类的混合体系。Zheng等用阴离子交换PA1柱从棉花中提取到的鼠李葡萄糖苷中分离得到1个新寡糖。Hu等用阴离子交换树脂柱层析研究了夹竹桃样品酸水解后的寡糖成分。
3. 5 其它分离方法
实际工作中石墨化碳柱高压液相色谱也被广泛应用;研究者常使用高效毛细管电泳法分离衍生化后的寡糖;纸色谱、纸电泳和纤维柱层析等技术也用于检测与分离寡糖。目前有一些新的分离方法,如国内外有些实验室用超过滤法得到一定相对分子质量范围的低聚糖;彭红等用聚丙烯酰胺凝胶(Bio2Gel P22)柱层析分离纯化纤维低聚糖,并分析了凝胶柱长、洗脱速度和上样浓度对分离效果的影响。
4 寡糖的结构分析方法
要确定寡糖的化学结构先要保证其纯度。目前常用鉴定纯度的方法有超离心法(形成单一的区带) 、高压电泳法(呈现一个斑点)和凝胶过滤法(形状对称的单一峰) 。目前分析寡糖结构的方法有( 1)化学法:部分/完全酸水解、甲基化分析、Smith降解、过碘酸氧化、乙酰解、甲醇解、三氧化铬氧化等; (2)物理法:核磁共振、质谱等; (3)生物学法:主要用于酶解产物的分析。
4. 1 化学方法
水解生物大分子成为易测定的短链片段,从而推导出寡糖糖链的结构。控制酸的浓度、温度、时间等可以实现寡糖的部分和完全水解。在薄层板上展开水解的寡糖,对照已知的单糖,可以确定寡糖的单糖成分组成。得知单糖组成后,用甲基化反应确定单糖连接顺序及连接位置。糖分子中的游离羟基通过甲基化反应全部被甲基取代得到甲基化寡糖,水解后得到甲基化单糖。气相色谱提供的寡糖大部分结构信息,都是通过分离鉴定寡糖的甲基化水解产物完成的。目前采用最广泛的是Hakomori法,一般反应一次即可实现完全甲基化。通过高碘酸反应测定高碘酸消耗量和甲酸释放量,可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度等信息;通过Smith降解,用过碘酸盐氧化糖链,以NaBH4还原后用弱酸部分水解,生成具有特征性糖连接的重复单元,获得更多的结构信息。
4. 2 物理方法
4. 2. 1 质谱 目前质谱是化合物结构推导、确定、定性定量的主要方法,具有高灵敏度和专属性,对测定试样量的要求越来越低。常用的质谱有(1)电喷雾电离质谱,将试样中分子转变成气相离子,产生的离子碎片化反应因异构体不同而有所差异,因此,寡糖及其缀合物在过碘酸氧化、还原、甲基化前后用电喷雾电离质谱和碰撞诱导分解联用技术可获得不同的碎片离子,由此可获知pmol级的寡糖及其缀合物的相对分子质量、序列、分支和连接信息; (2)快原子轰击质谱,实现了极性强、不挥发以及热不稳定的化合物不经衍生化就可直接分析, Seidel等分析了从灰闭鳞番荔枝树皮中得到的2个新寡糖组分;(3)基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱,产生的分子离子十分稳定,不易裂解,对测定天然混合物中非衍生化寡糖的分子量分布格外有用;现常以2, 52二羟基苯甲酸作为基质。
4. 2. 2 核磁共振 使用核磁共振,糖链的各种结构特征均可在结构表征基团的微小位移变化中显示。各种－D－NMR 和NOE等数据对分析糖链一级结构及其溶液构象也是必不可少的。核磁共振可获得糖残基数量、糖残基组成、异头碳构型、连接位点及顺序、取代基的位置等5种结构信息。缪振春等报道了一种新的测定寡糖链糖体亚谱的NMR 法,该技术可克服1H NMR解析中糖环质子信号的彼此重叠,得到更完整更详细的结构信息。
4. 2. 3 电泳 用于分析寡糖结构的电泳技术主要包括(1)毛细管电泳不仅是有效的分离手段,还可用于分析寡糖的组成、纯度鉴定和结构归属。既可直接分析复杂寡糖,得到寡糖微观不均一性的信息,又可定性、定量分析寡糖的酶解产物,得出寡糖链的完整结构; (2)十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳－聚偏氟乙烯薄膜电迁移技术:可以将电泳凝胶上的糖蛋白定量转移到聚偏氟乙烯薄膜上,直接酸水解后分析其氨基酸和糖基组成;也可以进行溴化氰降解、各种蛋白酶、糖肽酶和糖苷酶水解,或将膜直接置于蛋白质气相序列仪或质谱上进行序列分析,获得pmol级糖蛋白的肽链和糖链结构以及糖肽连接方式;(3)荧光基团辅助的糖电泳技术:可平行地分离和定量分析多个寡糖样品,快速灵敏,分辨率高。以荧光基团衍生化标记糖类分子的还原端羰基后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,既增强了寡糖分子的检测灵敏度,又使呈中性的糖类分子带电荷在电泳系中分离。荧光试剂主要有8－氨基萘－1, 3, 6, 2三磺酸和2－氨基吖啶酮,分别用于分离中性和酸性寡糖。该技术与酶解方法相结合可方便、灵敏地分析寡糖结构。常理文等研究多种寡糖(如异麦芽三糖、异麦芽四糖等)经α2萘胺衍生化后,用硼砂作为电泳介质的毛细管电泳行为,并对影响分离度的诸因素进行了考察。
4. 3 酶学技术
糖类结构的酶学方法中,通常用糖苷酶消化寡糖以推测其化学结构。由于酶解的高度专一性和放射标记方法的引入,使得此法十分有效并广为采用。它在糖链结构研究中的作用是(1)通过顺序降解,阐明糖链的一级结构; ( 2)确定每个单糖的异头构型; (3)从糖复合物上切得完整的糖链。糖苷酶可分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。外切酶只能切下非还原末端的一个单糖,对糖基组成和糖苷键有专一性要求,可通过水解逐步降解糖链,提供糖基组成、排列顺序及糖苷键的α－或β－异头构型的信息;内切酶可水解糖链内部的糖苷键,释放糖链片断,可从肽链上切下完整的糖链,有时还可将长的糖链切为较短的寡糖片段,以利于结构分析。
上述方法的最大缺陷是酶解结束后需要多次分离和确定产物的流体动力学体积。实际工作中可用N －聚糖的试剂阵列分析法解决此问题。但由于糖蛋白上O2连接糖链的高度复杂性和许多连接特异性的糖苷酶无法获得,此法目前只适用于结构规律较明确的N糖链。
4. 4 其他分析方法
红外光谱, X射线衍射,一维SEMDY谱和旋转坐标系NOE差谱相配合法等在实际分析工作中也得到应用。此外,郑小迅等以葡聚寡糖为模型分子,建立了一种以( + ) 2MNB甲酸荧光衍生化及高效液相色谱分析为基础新的寡糖链结构分析方法,可以同时获得组成单糖种类、糖链分支位点及组成单糖的D, L －构型3种结构信息。
5 寡糖的生物活性
5. 1 免疫调节2抗肿瘤
作为多糖类降解后的产物,寡糖可能是多糖发挥生物学效应的一个活性片段。寡糖不仅可以通过不同途径调节、增强免疫系统功能,而且可与免疫活性细胞上的糖受体结合,促其释放细胞因子和激素,活化下游的效应细胞。Yuan等研究发现,红藻κ2卡拉胶寡糖能显著抑制S180荷瘤小鼠体内移植瘤的生长,并增强巨噬细胞的吞噬功能,促进脾细胞形成并分泌抗体,加速淋巴细胞的增殖,提高自然杀伤细胞的活性以及白介素－2和肿瘤坏死因子－α的水平。
5. 2 降血糖
近期文献报道,寡糖降血糖的作用机制主要有:增加胰岛β细胞分泌,提高机体胰岛素水平;保护、修复胰岛β细胞而增加血液中胰岛素的水平;抑制α2葡糖苷酶活性;抑制糖异生,促进外周组织对糖的利用;抑制醛糖还原酶;调节葡糖激酶和葡糖262磷酸酶活性等。Lu等利用链脲佐菌素( STZ)诱导的糖尿病模型研究从魔芋根提取的3个寡糖,表明其中相对分子质量为666的四糖是有效的降血糖成分,低浓度(1.5mmol)时能明显降低胰岛中由STZ诱发的NO +自由基水平,同时增加胰岛素分泌。
5. 3 增强造血功能
近年研究表明,中药中的多糖或寡糖类有效成分对造血系统有很好的促进作用。地黄寡糖是近年地黄补血活性研究的主要对象,可增强正常小鼠和造血功能低下小鼠的骨髓造血功能。武卫红使用实验血液学检测造血系统功能的常规方法,用造血祖细胞体外培养技术考察了从地黄中提取的水苏糖和甘露三糖,证明两者有促进造血的作用,且甘露三糖促进造血祖细胞增殖分化的作用强于水苏糖,其作用途径可能是促进分泌造血生长因子。
5. 4 其他
有些寡糖还具有保护胃肠道、抗感染、抗休克、抗过敏、保护肝脏及抗过氧化等作用。金黎明等研究发现,壳聚糖有抗氧化能力,对CCl4 诱导的小鼠肝损伤有较好的保护作用,但不能减轻DNA的氧化性损伤。L iu等实验证明,壳聚糖能有效地保护人脐静脉内皮细胞以避免H2O2 诱发的应激损伤,提示了临床治疗心血管疾病的方法。
6 结语
各种自动化分离分析仪器的进步使得寡糖分离和结构测定更加准确、高效和灵敏;现代医学和分子生物学的不断发展,促进了探索寡糖生物活性的研究进程,有助于阐明寡糖结构与其生理活性之间的联系。所有这些都为寡糖的研究开发、产业化以及临床应用提供了有力的工具和新的途径。
1 寡糖的分类
寡糖类组分多以游离状态存在于植物体和果实中。构成寡糖的单糖主要是葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等五碳糖和六碳糖。
根据寡糖的单糖组成可分为同寡糖和杂寡糖,前者由同类单糖组成,后者由不同单糖组成;根据分子中是否存在游离的半缩醛羟基,还可分为还原性寡糖和非还原性寡糖,前者为糖基2糖基2糖的形式,后者为糖基2糖基2糖苷的形式;根据生物学功能可分为普通寡糖和功能性寡糖,前者可被机体消化吸收,产生能量,如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、环糊精、麦芽寡糖等,后者具有特殊的生理学功能但不被肠道吸收。还有一类寡糖是在侧链上修饰不同的化学基团,如胺基、羟基、硫酸基等,此类产物有糖醛酸、胺基糖、脱氧糖等。
2 寡糖的提取与制备
目前主要有从天然产物直接提取、酶催化合成或酶解天然多糖、酸水解天然多糖和化学合成等4种途径。
2. 1 天然产物直接提取
从天然原料中提取未衍生化的寡糖产品十分困难。目前适用此法的寡糖有棉籽糖(从甜菜提取) 、大豆寡糖(从大豆乳清提取) 、黑曲霉寡糖(从菌体提取)等。近年此法不断取得进展。武卫红用不同体积的75 %乙醇室温提取鲜地黄中的总寡糖。Kotiguda等用70 %乙醇室温浸泡菜豆, 130 r/min摇床提取13 h,用薄层色谱和纸色谱在提取液中检测到筋骨草糖(六糖) 。
2. 2 化学合成
最常用的糖苷键合成法是1901年由Koenigs等建立的,由于氯代或溴代异头碳稳定性差,故反应产率低,立体选择性差。此法的改进以异头碳氟代物作为糖基供体最为成功。1980年Schmidt建立的三氯乙酰亚氨酰法是现代寡糖合成的首选方法。
近年,以硫代异头碳作为合成糖苷键的糖基供体是另一种较常用的方法,这些硫代基团包括硫醚、各种硫酚醚、氢硫基硫代基、砜、亚砜以及硫羟酸、硫代羟酸等。
2. 3 酶催化反应合成或酶解天然多糖
酶催化反应立体特异性强,对反应底物、糖苷键的类型及位置等均有特定要求。用于寡糖合成的酶包括糖基转移酶、糖苷水解酶及磷酸化酶等3 大类。合成原料主要有淀粉类、蔗糖、乳糖等。卢丽丽等介绍了获得和筛选各种糖苷合成酶及其合成反应机制,为寡糖的工业化生产提供了新的选择。天然多糖在自然界分布广泛。植物体就是多糖的天然储藏库,而微生物的细胞壁也由多糖组成。丰富的原料来源是酶解多糖生产寡糖的最显著优势。Pastell等用α－L－阿拉伯糖苷酶和内切木聚糖酶将麦芽阿拉伯木聚糖逐步酶解成4个寡糖。Roncal等比较了用纤维素酶、胃蛋白酶和脂肪酶A以及壳多糖酶酶解壳多糖得到壳寡糖,探索了胃蛋白酶酶解获得高产率壳寡糖的反应条件。
2. 4 酸水解天然多糖
酸水解法由于产物成分复杂,目的寡糖产率低下,不易得到高活性寡糖而未被推广应用。但是,用于某些研究中得到目的寡糖,例如Hu等在夹竹桃提取的多糖中用酸水解法得到
3个低聚半乳糖。
3 寡糖的分离
寡糖混合物的分离是研究的重点和难点之一,主要原因是(1)寡糖有相似的化学组成,多种可能的异构体,多种连接方式和分支形式,结构异常复杂; ( 2)寡糖分子缺乏生色团或荧光团,检测较困难,而有重要生理活性的糖缀合物中的寡糖组分可得量很小。目前可供分离的方法如下。
3. 1 活性炭柱层析
一般用活性炭与天然硅藻土等量混合的吸附柱分离寡糖。活性炭价格低廉、选择性强、吸附量大;天然硅藻土使溶液易流过。先用水洗脱单糖,继而在水中增加乙醇的浓度从而顺次洗出二糖、三糖以及更高聚合度的寡糖。此法分离容量大,适用范围广,既可用于不同聚合度寡糖的分离,又可用于混合糖、糖酸、糖醇和糖的乙酰酯、氨基低聚糖以及糖甲基醚的分离。糖样中含有的无机盐对分离没有影响,糖样溶液的浓度通常为
1 % ～10 %。近年活性炭柱层析被广泛应用, Kawazoe等用活性炭2天然硅藻土层析柱等方法从50种水果和蔬菜的提取物发酵液中分离到2个新的寡糖。但是,研究者也发现了此法的不足。唐岚等在分离生地黄低聚糖时,发现由于活性炭对糖的吸附力强,洗脱剂用量非常大,且无法将三、四糖与单双糖有效分离。因此,应根据分离样品的性质选择最合适的分离手段。
3. 2 硅胶薄层/柱层析
此法是最常用的分离手段之一。但是糖的极性强,硅胶薄层点样量一般不大于5μg,量多时色点形状变长, Rf值下降,难以分离Rf值相近的糖。用硼酸溶液或无机盐水溶液代替水调制吸附剂涂铺薄层,可显著提高样品承载量和分离效果。
3. 3 葡聚糖凝胶层析法
此法使用的固定相2凝胶具有分子筛的性质,分离多种成分时馏分按相对分子质量递减的顺序排列。以适当的溶液浸泡凝胶颗粒,充分溶胀后装柱,加样后用同一溶液洗脱。此法克服了糖在硅胶柱上吸附力太强的缺点,在规格选择合适情况时,可得到相当理想的分离效果,且洗脱剂用量少,层析时间短。郝林华等用Sephadex G250凝胶柱层析,从牛蒡根提取的糖样品中分离得到水溶性牛蒡寡糖。
3. 4 离子交换树脂柱层析
此法利用各糖分吸附力的不同达到分离目的。常使用具有某种结合型的强酸性或弱酸性阳离子树脂、强碱性或弱碱性以及大孔球型阴离子树脂。不同的洗脱条件可分离单糖混合物、单糖、双糖、三糖、四糖和五糖组成的体系,也可用于分离单糖、脱氧糖和糖衍生物的复杂样品,以及含有不同构型的吡喃苷及呋喃糖苷的混合物及其它糖类的混合体系。Zheng等用阴离子交换PA1柱从棉花中提取到的鼠李葡萄糖苷中分离得到1个新寡糖。Hu等用阴离子交换树脂柱层析研究了夹竹桃样品酸水解后的寡糖成分。
3. 5 其它分离方法
实际工作中石墨化碳柱高压液相色谱也被广泛应用;研究者常使用高效毛细管电泳法分离衍生化后的寡糖;纸色谱、纸电泳和纤维柱层析等技术也用于检测与分离寡糖。目前有一些新的分离方法,如国内外有些实验室用超过滤法得到一定相对分子质量范围的低聚糖;彭红等用聚丙烯酰胺凝胶(Bio2Gel P22)柱层析分离纯化纤维低聚糖,并分析了凝胶柱长、洗脱速度和上样浓度对分离效果的影响。
4 寡糖的结构分析方法
要确定寡糖的化学结构先要保证其纯度。目前常用鉴定纯度的方法有超离心法(形成单一的区带) 、高压电泳法(呈现一个斑点)和凝胶过滤法(形状对称的单一峰) 。目前分析寡糖结构的方法有( 1)化学法:部分/完全酸水解、甲基化分析、Smith降解、过碘酸氧化、乙酰解、甲醇解、三氧化铬氧化等; (2)物理法:核磁共振、质谱等; (3)生物学法:主要用于酶解产物的分析。
4. 1 化学方法
水解生物大分子成为易测定的短链片段,从而推导出寡糖糖链的结构。控制酸的浓度、温度、时间等可以实现寡糖的部分和完全水解。在薄层板上展开水解的寡糖,对照已知的单糖,可以确定寡糖的单糖成分组成。得知单糖组成后,用甲基化反应确定单糖连接顺序及连接位置。糖分子中的游离羟基通过甲基化反应全部被甲基取代得到甲基化寡糖,水解后得到甲基化单糖。气相色谱提供的寡糖大部分结构信息,都是通过分离鉴定寡糖的甲基化水解产物完成的。目前采用最广泛的是Hakomori法,一般反应一次即可实现完全甲基化。通过高碘酸反应测定高碘酸消耗量和甲酸释放量,可以判断糖苷键的位置、直链多糖的聚合度等信息;通过Smith降解,用过碘酸盐氧化糖链,以NaBH4还原后用弱酸部分水解,生成具有特征性糖连接的重复单元,获得更多的结构信息。
4. 2 物理方法
4. 2. 1 质谱 目前质谱是化合物结构推导、确定、定性定量的主要方法,具有高灵敏度和专属性,对测定试样量的要求越来越低。常用的质谱有(1)电喷雾电离质谱,将试样中分子转变成气相离子,产生的离子碎片化反应因异构体不同而有所差异,因此,寡糖及其缀合物在过碘酸氧化、还原、甲基化前后用电喷雾电离质谱和碰撞诱导分解联用技术可获得不同的碎片离子,由此可获知pmol级的寡糖及其缀合物的相对分子质量、序列、分支和连接信息; (2)快原子轰击质谱,实现了极性强、不挥发以及热不稳定的化合物不经衍生化就可直接分析, Seidel等分析了从灰闭鳞番荔枝树皮中得到的2个新寡糖组分;(3)基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱,产生的分子离子十分稳定,不易裂解,对测定天然混合物中非衍生化寡糖的分子量分布格外有用;现常以2, 52二羟基苯甲酸作为基质。
4. 2. 2 核磁共振 使用核磁共振,糖链的各种结构特征均可在结构表征基团的微小位移变化中显示。各种－D－NMR 和NOE等数据对分析糖链一级结构及其溶液构象也是必不可少的。核磁共振可获得糖残基数量、糖残基组成、异头碳构型、连接位点及顺序、取代基的位置等5种结构信息。缪振春等报道了一种新的测定寡糖链糖体亚谱的NMR 法,该技术可克服1H NMR解析中糖环质子信号的彼此重叠,得到更完整更详细的结构信息。
4. 2. 3 电泳 用于分析寡糖结构的电泳技术主要包括(1)毛细管电泳不仅是有效的分离手段,还可用于分析寡糖的组成、纯度鉴定和结构归属。既可直接分析复杂寡糖,得到寡糖微观不均一性的信息,又可定性、定量分析寡糖的酶解产物,得出寡糖链的完整结构; (2)十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳－聚偏氟乙烯薄膜电迁移技术:可以将电泳凝胶上的糖蛋白定量转移到聚偏氟乙烯薄膜上,直接酸水解后分析其氨基酸和糖基组成;也可以进行溴化氰降解、各种蛋白酶、糖肽酶和糖苷酶水解,或将膜直接置于蛋白质气相序列仪或质谱上进行序列分析,获得pmol级糖蛋白的肽链和糖链结构以及糖肽连接方式;(3)荧光基团辅助的糖电泳技术:可平行地分离和定量分析多个寡糖样品,快速灵敏,分辨率高。以荧光基团衍生化标记糖类分子的还原端羰基后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,既增强了寡糖分子的检测灵敏度,又使呈中性的糖类分子带电荷在电泳系中分离。荧光试剂主要有8－氨基萘－1, 3, 6, 2三磺酸和2－氨基吖啶酮,分别用于分离中性和酸性寡糖。该技术与酶解方法相结合可方便、灵敏地分析寡糖结构。常理文等研究多种寡糖(如异麦芽三糖、异麦芽四糖等)经α2萘胺衍生化后,用硼砂作为电泳介质的毛细管电泳行为,并对影响分离度的诸因素进行了考察。
4. 3 酶学技术
糖类结构的酶学方法中,通常用糖苷酶消化寡糖以推测其化学结构。由于酶解的高度专一性和放射标记方法的引入,使得此法十分有效并广为采用。它在糖链结构研究中的作用是(1)通过顺序降解,阐明糖链的一级结构; ( 2)确定每个单糖的异头构型; (3)从糖复合物上切得完整的糖链。糖苷酶可分为外切糖苷酶和内切糖苷酶。外切酶只能切下非还原末端的一个单糖,对糖基组成和糖苷键有专一性要求,可通过水解逐步降解糖链,提供糖基组成、排列顺序及糖苷键的α－或β－异头构型的信息;内切酶可水解糖链内部的糖苷键,释放糖链片断,可从肽链上切下完整的糖链,有时还可将长的糖链切为较短的寡糖片段,以利于结构分析。
上述方法的最大缺陷是酶解结束后需要多次分离和确定产物的流体动力学体积。实际工作中可用N －聚糖的试剂阵列分析法解决此问题。但由于糖蛋白上O2连接糖链的高度复杂性和许多连接特异性的糖苷酶无法获得,此法目前只适用于结构规律较明确的N糖链。
4. 4 其他分析方法
红外光谱, X射线衍射,一维SEMDY谱和旋转坐标系NOE差谱相配合法等在实际分析工作中也得到应用。此外,郑小迅等以葡聚寡糖为模型分子,建立了一种以( + ) 2MNB甲酸荧光衍生化及高效液相色谱分析为基础新的寡糖链结构分析方法,可以同时获得组成单糖种类、糖链分支位点及组成单糖的D, L －构型3种结构信息。
5 寡糖的生物活性
5. 1 免疫调节2抗肿瘤
作为多糖类降解后的产物,寡糖可能是多糖发挥生物学效应的一个活性片段。寡糖不仅可以通过不同途径调节、增强免疫系统功能,而且可与免疫活性细胞上的糖受体结合,促其释放细胞因子和激素,活化下游的效应细胞。Yuan等研究发现,红藻κ2卡拉胶寡糖能显著抑制S180荷瘤小鼠体内移植瘤的生长,并增强巨噬细胞的吞噬功能,促进脾细胞形成并分泌抗体,加速淋巴细胞的增殖,提高自然杀伤细胞的活性以及白介素－2和肿瘤坏死因子－α的水平。
5. 2 降血糖
近期文献报道,寡糖降血糖的作用机制主要有:增加胰岛β细胞分泌,提高机体胰岛素水平;保护、修复胰岛β细胞而增加血液中胰岛素的水平;抑制α2葡糖苷酶活性;抑制糖异生,促进外周组织对糖的利用;抑制醛糖还原酶;调节葡糖激酶和葡糖262磷酸酶活性等。Lu等利用链脲佐菌素( STZ)诱导的糖尿病模型研究从魔芋根提取的3个寡糖,表明其中相对分子质量为666的四糖是有效的降血糖成分,低浓度(1.5mmol)时能明显降低胰岛中由STZ诱发的NO +自由基水平,同时增加胰岛素分泌。
5. 3 增强造血功能
近年研究表明,中药中的多糖或寡糖类有效成分对造血系统有很好的促进作用。地黄寡糖是近年地黄补血活性研究的主要对象,可增强正常小鼠和造血功能低下小鼠的骨髓造血功能。武卫红使用实验血液学检测造血系统功能的常规方法,用造血祖细胞体外培养技术考察了从地黄中提取的水苏糖和甘露三糖,证明两者有促进造血的作用,且甘露三糖促进造血祖细胞增殖分化的作用强于水苏糖,其作用途径可能是促进分泌造血生长因子。
5. 4 其他
有些寡糖还具有保护胃肠道、抗感染、抗休克、抗过敏、保护肝脏及抗过氧化等作用。金黎明等研究发现,壳聚糖有抗氧化能力,对CCl4 诱导的小鼠肝损伤有较好的保护作用,但不能减轻DNA的氧化性损伤。L iu等实验证明,壳聚糖能有效地保护人脐静脉内皮细胞以避免H2O2 诱发的应激损伤,提示了临床治疗心血管疾病的方法。
6 结语
各种自动化分离分析仪器的进步使得寡糖分离和结构测定更加准确、高效和灵敏;现代医学和分子生物学的不断发展,促进了探索寡糖生物活性的研究进程,有助于阐明寡糖结构与其生理活性之间的联系。所有这些都为寡糖的研究开发、产业化以及临床应用提供了有力的工具和新的途径。
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