西门子流量计dn500:ＲＡＰＤ　ＡＦＬＰ等技术特点

1.RFLP

限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism，缩写RFLP) 技术的原理是检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小。因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变（新产生和去除酶切位点）和 一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致RFLP的产生。

技术路线：

缺点：

RFLP分析对样品纯度要求较高，样品用量大，且RFLP多态信息含量低，多态性水平过分依赖于限制性内切酶的种类和数量，加之RFLP分析技术步骤繁琐、工作量大、成本较高，所以其应用受到了一定的限制

RFLP原理图示：

2.RAPD

原理：RAPD技术的全称是随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA)，此技术建立于PCR基础之上，使用一系列具有10个左右碱基的单链随机引物，对基因组的DNA全部进行PCR扩增，以检测多态性。由于整个基因组存在众多反向重复序列，因此须对每一随机引物单独进行PCR。单一引物与反向重复序列结合。使重复序列之间的区域得以扩增。引物结合位点DNA序列的改变以及两扩增位点之间DNA碱基的缺失、插入或置换均可导致扩增片段数目和长度的差异，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后通过EB染色以检测DNA片段的多态性。

原理示意图：

若位点2处碱基发生改变，则

技术路线：

RAPD的缺点：

    RADP图谱中某些弱带重复性较差，而且目前该法在引物长度和序列及应用的引物数目、扩增反应条件等实验技术方面未标准化，影响了不同条件下结果的可比性；每个标记含有的信息量小；有假阳性或假阴性结果；显性标记，无法区分从一个位点扩增的DNA片段是纯合的还是杂合的，无法进行等位基因分析。用在种以上类群间的比较时无法得到可靠的遗传距离.

3.AFLP

原理：AFLP的全称是扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism）,此技术是建立在基因组限制性片段基础上的PCR 扩增。由于不同物种的基因组DNA 大小不同,基组DNA 经限制性内切酶酶切后,产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA 片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对摸板DNA 进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据凝胶上DNA 指纹的有无来检出多态性.

原理示意图：

(1)．

(2).

(3).

(4).

(5).

(6).

(7). 

技术路线：

AFLP的缺点：

此技术受到专利保护，应用受到限制，试剂盒价格昂贵。

另外，操作中通常要利用同位素标记，对样品DNA质量要求严格。

4微卫星SSR（simple sequence repeats）

原理：微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在1—10bp之间，常见的微卫星如TGTG……TG= (TG)n或AATAAT……AAT= (AAT)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。在基因组中，因每个SSR序列的基本单元重复次数在不同基因型间差异很大，从而形成其座位的多态性。而且每个SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(Flanking Region)，寻找其中的特异保守区。

技术路线：

建立DNA文库，筛选鉴定微卫星DNA克隆，然后测定这些克隆的侧翼序列，设计特异性引物来扩增SSR序列。后经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色，通过比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。

微卫星的优点：

（1）微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中。据估计，在基因组中

平均30—50kb就存在一个微卫星，为在整个基因组中定位更多的

基因提供了极大的方便

（2）微卫星DNA具有丰富的多态性，并且微卫星位点检测可以显示

纯合子和杂合子。

（3）微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析。

通过GeneScan检测，一个位点的检测一般可在24h内完成，且可

同时进行多位点的检测。

5.线粒体DNA标记

原理：线粒体基因组是独立于核基因组的遗传物质，它普遍存在于真核细胞中，线粒体内包含有DNA和转录与转译系统，是具有一定自主性的细胞器。线粒体基因组具有的独特优点：线粒体DNA分子小、拷贝数高; 结构和组织简单而高度保守; 母系遗传，缺乏重组; DNA突变率高.

6.EST(expressed sequence tag)表达序列标签