偶看新闻延安楼房屋出租:氨基酸生产有机肥
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/05/02 04:35:55
氨基酸生产有机肥
氨基酸生产工艺 氨基酸的用途 食品工业： 1. 食品工业： 增鲜剂： 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜 味剂(α 天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981 (α),此产品1981年 味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年 获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。 FDA批准,现在每年产量已达数万吨。 批准 饲料工业： 2. 饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 医药工业： 3. 医药工业： 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代 谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气 对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 化学工业： 4. 化学工业： 谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。 谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。 第一节 氨基酸的生产 一、氨基酸的生产方法 ? 发酵法： 发酵法： 直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变 直接发酵法：野生菌株发酵、 发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、 发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨 基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵 和营养缺陷型回复突变株发酵。 和营养缺陷型回复突变株发酵。 添加前体法 ? 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的 酶法： 酶来制造氨基酸。 酶来制造氨基酸。 ? 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。 胱氨酸、 胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 ? 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、 苯丙氨酸。 苯丙氨酸。 传统的提取法、 传统的提取法、酶法和化学合成法由于 前体物的成本高,工艺复杂, 前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工 业化生产的目的。 业化生产的目的。 ? 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。 20多种 ? 生产氨基酸的大国为日本和德国。 生产氨基酸的大国为日本和德国。 ? 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世 日本的味之素、 界氨基酸生产的三巨头。 界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的 氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 ? 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产 日本在美国、 厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。 厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。 ? 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司, 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司, 湖北八峰氨基酸公司, 湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产 品质量还难于与国外抗衡。 品质量还难于与国外抗衡。 二、氨基酸产生菌的选育 ? 所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主 所谓氨基酸发酵, 要原料的培养基中培养微生物, 要原料的培养基中培养微生物,积累特定 的氨基酸。 的氨基酸。 ? 这些方法成立的一个重要原因是使用选 育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。 育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。 1、用野生株的方法 ? 这是从自然界获得的分离菌株进行发酵 生产的一种方法。 生产的一种方法。 ? 典型的例子就是谷氨酸发酵。 典型的例子就是谷氨酸发酵。 ? 改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵 改变培养条件的发酵转换法中, 离子浓度、磷酸浓度， 离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷 氨酰胺和缬氨酸发酵 2、用营养缺陷变异株的方法 ? 这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成 某步反应阻遏的营养缺陷型变异体， 某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生 物合成在中途停止， 物合成在中途停止，不让最终产物起控制 作用。 作用。 ? 这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸 发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵， 发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵， 还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。 还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。 3、类似物抗性变异株的方法 ? 用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化 合物加入培养基内，使其发生控制作用， 合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而 抑制微生物的生长。这样， 抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种 培养基中能够生长的变异株， 培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正 是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。 是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。 ? 利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮 利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、 氨酸、组氨酸和精氨酸。 氨酸、组氨酸和精氨酸。 四、氨基酸发酵的工艺控制 ? 培养基 ? pH ? 温度 ?氧 (一）培养基 ? 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、 醇、烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨 碳源浓度过高时，对菌体生长不利， 基酸的转化率降低。 基酸的转化率降低。 菌种性质、 菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的 发酵操作决定碳源种类 2、氮源：铵盐、尿素、氨水； 氮源：铵盐、尿素、氨水； ? 同时调整pH值 同时调整pH值 pH ? 营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液 ? 需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源 需生物素和氨基酸， ? 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌，可分批流加 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌， ? 氨水用pH自动控制连续流加 氨水用pH自动控制连续流加 pH ? 3、合适C/N 合适C/N ? 氮源用于调整pH 氮源用于调整pH ? 合成菌体 ? 生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的 生成氨基酸， C/N高 C/N高。 (二）pH对氨基酸发酵的影响及其控制 pH对氨基酸发酵的影响及其控制 ? 作用机理：主要影响酶的活性和菌的 作用机理： 代谢。 代谢。 ? 控制pH方法：流加尿素和氨水 控制pH方法： pH方法 ? 流加方式：根据菌体生长、pH变化、 流加方式：根据菌体生长、pH变化、 变化 糖耗情况和发酵阶段等因素决定。 糖耗情况和发酵阶段等因素决定。 控制： 控制： ? （1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素， 菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素， 避免pH pH过高 避免pH过高 ? （2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些， 菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些， 以抑制菌体生长。 以抑制菌体生长。 ? （3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或 发酵后期，残糖少，接近放罐时， 不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。 不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。 ? （4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。 氨水对pH影响大，应采取连续流加。 pH影响大 (三）温度对氨基酸发酵的影响及其控制 ? 菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因 菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸， 此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度 是不同的。 是不同的。 ? 菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖 菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高 耗慢，周期长，酸产量低。 耗慢，周期长，酸产量低。 ? 采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长 采取措施：少量多次流加尿素， 温度，减少风量等，促进菌体生长。 温度，减少风量等，促进菌体生长。 (四）氧对氨基酸发酵的影响及其控制 ? 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵： 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵： 生物合成与TCA循环有关。 TCA循环有关 生物合成与TCA循环有关。 ? 适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙 适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、 氨酸和缬氨酸发酵： 氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产 量最大。 量最大。 ? 供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸 族氨基酸发酵 第二节 谷氨酸生产工艺 ? 工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。 工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。 ? 1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规 1957年 日本率先采用微生物发酵法生产， 模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举， 模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举， 使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 ? 目前世界产谷氨酸钠30万吨/年，占氨基酸总量的2/3。 目前世界产谷氨酸钠30万吨/ 30万吨 占氨基酸总量的2/3。 2/3 ? 我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。 我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。 200余家生产 15万吨 产生菌株特点： 产生菌株特点： ? 革兰氏阳性 ? 不形成芽胞 ? 没有鞭毛，不能运动 没有鞭毛， ? 需要生物素作为生长因子 ? 在通气条件下才能产生谷氨酸 谷氨酸生物合成机理： 谷氨酸生物合成机理： ? 由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在 由三羧酸循环中产生的a 酮戊二酸， 谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原 性氨化作用而得到。 性氨化作用而得到。 一、淀粉水解糖的制备 ? 1、调浆：干淀粉用水调成淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％ 调浆：干淀粉用水调成淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％ 0.5 pH1.5。 至pH1.5。 ? 2、糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80℃下 糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80℃下 25min 80℃ 中和。 中和。 ? 3、中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0 中和：烧碱中和， pH4.0? 4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.60.6 0.8％， 70℃及酸性条件下搅拌后过滤 ％，在 及酸性条件下搅拌后过滤。 0.8％，在70℃及酸性条件下搅拌后过滤。 ? 酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用 酶法糖化： 大米进行浸泡磨浆，加细菌a 大米进行浸泡磨浆，加细菌a-淀粉酶进行液 85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h 60℃糖化24h， 化，85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h，过 滤后可供配制培养基。 滤后可供配制培养基。 ? 糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发 糖蜜原料： 酵的碳源，因含丰富的生物素。 酵的碳源，因含丰富的生物素。 ? 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚 预处理方法： 硝酸法吸附或破坏生物素。 硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发 酵液中加入表面活性剂吐温60 60或添加中 酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中 青霉素。 青霉素。 二、菌种扩大培养 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆 斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、 菌属、小杆菌属、节杆菌属。 菌属、小杆菌属、节杆菌属。 ? 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌 和北京棒杆菌及各种诱变株。 和北京棒杆菌及各种诱变株。 ? 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素 生长特点：适用于糖质原料，需氧， 为生长因子。 为生长因子。 ? 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、 pH7.0-7.2琼脂培养基 32℃培养18-24h。 琼脂培养基， 培养18 pH7.0-7.2琼脂培养基，32℃培养18-24h。 ? 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢 一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、 二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。 二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。 1000ml装200-250ml振荡 振荡， 培养12h 12h。 1000ml装200-250ml振荡，32℃ 培养12h。 ? 3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投 二级种子培养：用种子罐培养， 料体积的1％，用水解糖代替葡萄糖 用水解糖代替葡萄糖， 料体积的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃ 进行通 气搅拌7 10h。种子质量要求：二级种子培养结束时， 气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时， 无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一， 无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字 排列。活菌数为10 /ml。 排列。活菌数为108-109 /ml。 三、谷氨酸发酵 ? 1、适应期：尿素分解出氨使pH上升,糖不利用。 适应期：尿素分解出氨使pH上升,糖不利用。 pH上升 4h。 2-4h。 ? 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。 ? 2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上 对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上 pH 氨被利用pH又迅速下降。 pH又迅速下降 升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维 持在一定水平。菌体浓度迅速增大， 持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为 排列整齐的八字形。不产酸。12h。 排列整齐的八字形。不产酸。12h。 ? 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH， 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH， pH pH7.5-8.0时流加尿素 维持温度30 时流加尿素； 30在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30- 32℃ ? 3、菌体生长停止期：谷氨酸合成。 菌体生长停止期：谷氨酸合成。 ? 措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气， 措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气， pH维持在7.2 控制温度34 34℃。 控制温度34-37 ℃。 ? 4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 ? 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 ? 发酵周期一般为30h。 发酵周期一般为30h。 30h 四、谷氨酸发酵控制 ? 1、生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键 生物素： 酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在， CoA的辅酶 酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响 磷酯的合成。 磷酯的合成。 ? 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时， 谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。 形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。 ? 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖， 谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。 谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。 ? 2、种龄和种量的控制 ? 一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。 一级种子控制在11-12h，二级控制在7 8h。 11 ? 种量为1％。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老 种量为1％。过多，菌体娇嫩，不强壮， 过多 自溶，后期产酸量不高。 自溶，后期产酸量不高。 ? 3、pH ? 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低， pH较敏感 过低 体生长旺盛，营养成分消耗大， 体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵 长菌不长酸。 慢，长菌不长酸。 ? 谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适 谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2， pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。 pH不变 pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。过 高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。 高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。 ? 4、通风：不同种龄、种量，培养基成分，发 通风：不同种龄、种量，培养基成分， 酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。 酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。 ? 在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑 在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏， 制菌体生长。 制菌体生长。 ? 在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过 在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧， 量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风， 量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积 酮戊二酸。 累a-酮戊二酸。 ? 防止噬菌体和杂菌的污染 ? 从空气过滤、培养基、设备、环境等环 从空气过滤、培养基、设备、 节严格把关。 节严格把关。 五、谷氨酸的提取 1、等电点法：操作简单，收率60％。周 等电点法：操作简单，收率60％。周 60％。 期长，占地面积大。 期长，占地面积大。 2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取 离子交换法： 吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱， 吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱， 收集相应流分，再加盐酸结晶。 收集相应流分，再加盐酸结晶。 六、谷氨酸发酵研究新进展 ? 继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富 继续选育各种生化突变菌株：转化率提高， 含生物素的培养基中保持较高产酸水平。 含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利 用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。 用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。 ? 生物工程新技术的应用：体外DNA重组的基因工程和原 生物工程新技术的应用：体外DNA重组的基因工程和原 DNA 生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近1 生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近1倍。 ? 改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺，通过电子 改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺， 计算机控制发酵条件。 计算机控制发酵条件。 七、非糖质原料的谷氨酸发酵 ? 醋酸发酵谷氨酸 ? 机理：醋酸形成乙酰CoA，再进入TCA， 机理：醋酸形成乙酰CoA，再进入TCA， CoA TCA 因此凡能利用葡萄糖原料的菌种也可作 为醋酸发酵谷氨酸的菌株。 为醋酸发酵谷氨酸的菌株。 ? 以醋酸钠或醋酸铵与醋酸的混合液为原 且浓度不超过4％。发酵过程中也需 料，且浓度不超过4％。发酵过程中也需 流加以保持pH pH。 流加以保持pH。
氨基酸生产工艺 氨基酸的用途 食品工业： 1. 食品工业： 增鲜剂： 增鲜剂：谷氨酸单钠和天冬氨酸 苯丙氨酸与天冬氨酸可用于制造低热量二肽甜 味剂(α 天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981 (α),此产品1981年 味剂(α-天冬酰苯丙氨酸甲酯),此产品1981年 获FDA批准,现在每年产量已达数万吨。 FDA批准,现在每年产量已达数万吨。 批准 饲料工业： 2. 饲料工业： 甲硫氨酸等必需氨基酸可用于制造动物饲料 医药工业： 3. 医药工业： 多种复合氨基酸制剂可通过输液治疗营养或代 谢失调 苯丙氨酸与氮芥子气合成的苯丙氨酸氮芥子气 对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 对骨髓肿瘤治疗有效,且副作用低。 化学工业： 4. 化学工业： 谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。 谷氨基钠作洗涤剂,丙氨酸制造丙氨酸纤维。 第一节 氨基酸的生产 一、氨基酸的生产方法 ? 发酵法： 发酵法： 直接发酵法：野生菌株发酵、营养缺陷型突变 直接发酵法：野生菌株发酵、 发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、 发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨 基酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵 和营养缺陷型回复突变株发酵。 和营养缺陷型回复突变株发酵。 添加前体法 ? 酶法：利用微生物细胞或微生物产生的 酶法： 酶来制造氨基酸。 酶来制造氨基酸。 ? 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。 胱氨酸、 胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 ? 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、 苯丙氨酸。 苯丙氨酸。 传统的提取法、 传统的提取法、酶法和化学合成法由于 前体物的成本高,工艺复杂, 前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工 业化生产的目的。 业化生产的目的。 ? 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。 目前世界上可用发酵法生产氨基酸有20多种。 20多种 ? 生产氨基酸的大国为日本和德国。 生产氨基酸的大国为日本和德国。 ? 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世 日本的味之素、 界氨基酸生产的三巨头。 界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的 氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 ? 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产 日本在美国、 厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。 厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。 ? 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司, 国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司, 湖北八峰氨基酸公司, 湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产 品质量还难于与国外抗衡。 品质量还难于与国外抗衡。 二、氨基酸产生菌的选育 ? 所谓氨基酸发酵,就是以糖类和铵盐为主 所谓氨基酸发酵, 要原料的培养基中培养微生物, 要原料的培养基中培养微生物,积累特定 的氨基酸。 的氨基酸。 ? 这些方法成立的一个重要原因是使用选 育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。 育成的氨基酸生物合成高能力的菌株。 1、用野生株的方法 ? 这是从自然界获得的分离菌株进行发酵 生产的一种方法。 生产的一种方法。 ? 典型的例子就是谷氨酸发酵。 典型的例子就是谷氨酸发酵。 ? 改变培养条件的发酵转换法中,有变化铵 改变培养条件的发酵转换法中, 离子浓度、磷酸浓度， 离子浓度、磷酸浓度，使谷氨酸转向谷 氨酰胺和缬氨酸发酵 2、用营养缺陷变异株的方法 ? 这一方法是诱变出菌体内氨基酸生物合成 某步反应阻遏的营养缺陷型变异体， 某步反应阻遏的营养缺陷型变异体，使生 物合成在中途停止， 物合成在中途停止，不让最终产物起控制 作用。 作用。 ? 这种方法中有用高丝氨酸缺陷株的赖氨酸 发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵， 发酵，有用精氨酸缺陷株的鸟氨酸发酵， 还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。 还有用异亮氨酸缺陷株的脯氨酸发酵。 3、类似物抗性变异株的方法 ? 用一种与自己想获得的氨基酸结构相类似的化 合物加入培养基内，使其发生控制作用， 合物加入培养基内，使其发生控制作用，从而 抑制微生物的生长。这样， 抑制微生物的生长。这样，就可以得到在这种 培养基中能够生长的变异株， 培养基中能够生长的变异株，而这种变异株正 是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。 是解除了调控机制的，能够生成过量的氨基酸。 ? 利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、异亮 利用此方法发酵的有:苏氨酸、赖氨酸、 氨酸、组氨酸和精氨酸。 氨酸、组氨酸和精氨酸。 四、氨基酸发酵的工艺控制 ? 培养基 ? pH ? 温度 ?氧 (一）培养基 ? 1、碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、乙 碳源：淀粉水解糖、糖蜜、醋酸、 醇、烷烃 碳源浓度过高时，对菌体生长不利，氨 碳源浓度过高时，对菌体生长不利， 基酸的转化率降低。 基酸的转化率降低。 菌种性质、 菌种性质、生产氨基酸种类和所采用的 发酵操作决定碳源种类 2、氮源：铵盐、尿素、氨水； 氮源：铵盐、尿素、氨水； ? 同时调整pH值 同时调整pH值 pH ? 营养缺陷型添加适量氨基酸主要以添加有机氮源水解液 ? 需生物素和氨基酸，以玉米浆作氮源 需生物素和氨基酸， ? 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌，可分批流加 尿素灭菌时形成磷酸铵镁盐，须单独灭菌， ? 氨水用pH自动控制连续流加 氨水用pH自动控制连续流加 pH ? 3、合适C/N 合适C/N ? 氮源用于调整pH 氮源用于调整pH ? 合成菌体 ? 生成氨基酸，因此比一般微生物发酵的 生成氨基酸， C/N高 C/N高。 (二）pH对氨基酸发酵的影响及其控制 pH对氨基酸发酵的影响及其控制 ? 作用机理：主要影响酶的活性和菌的 作用机理： 代谢。 代谢。 ? 控制pH方法：流加尿素和氨水 控制pH方法： pH方法 ? 流加方式：根据菌体生长、pH变化、 流加方式：根据菌体生长、pH变化、 变化 糖耗情况和发酵阶段等因素决定。 糖耗情况和发酵阶段等因素决定。 控制： 控制： ? （1）菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素， 菌体生长或耗糖慢时，少量多次流加尿素， 避免pH pH过高 避免pH过高 ? （2）菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些， 菌体生长或耗糖过快时，流加尿素可多些， 以抑制菌体生长。 以抑制菌体生长。 ? （3）发酵后期，残糖少，接近放罐时，少加或 发酵后期，残糖少，接近放罐时， 不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。 不加尿素，以免造成氨基酸提取困难。 ? （4）氨水对pH影响大，应采取连续流加。 氨水对pH影响大，应采取连续流加。 pH影响大 (三）温度对氨基酸发酵的影响及其控制 ? 菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸，因 菌体生长达一定程度后再开始产生氨基酸， 此菌体生长最适温度和氨基酸合成的最适温度 是不同的。 是不同的。 ? 菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高，糖 菌体生长温度过高，则菌体易衰老，pH高 耗慢，周期长，酸产量低。 耗慢，周期长，酸产量低。 ? 采取措施：少量多次流加尿素，维持最适生长 采取措施：少量多次流加尿素， 温度，减少风量等，促进菌体生长。 温度，减少风量等，促进菌体生长。 (四）氧对氨基酸发酵的影响及其控制 ? 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵： 要求供氧充足的谷氨酸族氨基酸发酵： 生物合成与TCA循环有关。 TCA循环有关 生物合成与TCA循环有关。 ? 适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、苯丙 适宜在缺氧条件下进行的亮氨酸、 氨酸和缬氨酸发酵： 氨酸和缬氨酸发酵：菌体呼吸受阻时产 量最大。 量最大。 ? 供氧不足时产酸受轻微影响的天冬氨酸 族氨基酸发酵 第二节 谷氨酸生产工艺 ? 工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。 工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。 ? 1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规 1957年 日本率先采用微生物发酵法生产， 模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举， 模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举， 使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 ? 目前世界产谷氨酸钠30万吨/年，占氨基酸总量的2/3。 目前世界产谷氨酸钠30万吨/ 30万吨 占氨基酸总量的2/3。 2/3 ? 我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。 我国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。 200余家生产 15万吨 产生菌株特点： 产生菌株特点： ? 革兰氏阳性 ? 不形成芽胞 ? 没有鞭毛，不能运动 没有鞭毛， ? 需要生物素作为生长因子 ? 在通气条件下才能产生谷氨酸 谷氨酸生物合成机理： 谷氨酸生物合成机理： ? 由三羧酸循环中产生的a-酮戊二酸，在 由三羧酸循环中产生的a 酮戊二酸， 谷氨酸脱氢酶和氢供体存在下进行还原 性氨化作用而得到。 性氨化作用而得到。 一、淀粉水解糖的制备 ? 1、调浆：干淀粉用水调成淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％ 调浆：干淀粉用水调成淀粉乳，加盐酸0.5-0.8％ 0.5 pH1.5。 至pH1.5。 ? 2、糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80℃下 糖化：蒸汽加热，加压糖化25min。冷却至80℃下 25min 80℃ 中和。 中和。 ? 3、中和：烧碱中和，至pH4.0-5.0 中和：烧碱中和， pH4.0? 4、脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.6脱色：活性炭脱色和脱色树脂。活性炭用量为0.60.6 0.8％， 70℃及酸性条件下搅拌后过滤 ％，在 及酸性条件下搅拌后过滤。 0.8％，在70℃及酸性条件下搅拌后过滤。 ? 酶法糖化：以大米或碎米为原料时采用 酶法糖化： 大米进行浸泡磨浆，加细菌a 大米进行浸泡磨浆，加细菌a-淀粉酶进行液 85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h 60℃糖化24h， 化，85℃30min，加糖化酶60℃糖化24h，过 滤后可供配制培养基。 滤后可供配制培养基。 ? 糖蜜原料：不宜直接用来作为谷氨酸发 糖蜜原料： 酵的碳源，因含丰富的生物素。 酵的碳源，因含丰富的生物素。 ? 预处理方法：活性碳或树脂吸附法和亚 预处理方法： 硝酸法吸附或破坏生物素。 硝酸法吸附或破坏生物素。也可以在发 酵液中加入表面活性剂吐温60 60或添加中 酵液中加入表面活性剂吐温60或添加中 青霉素。 青霉素。 二、菌种扩大培养 1、斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、短杆 斜面培养：主要产生菌是棒状杆菌属、 菌属、小杆菌属、节杆菌属。 菌属、小杆菌属、节杆菌属。 ? 我国各工厂目前使用的菌株主要是钝齿棒杆菌 和北京棒杆菌及各种诱变株。 和北京棒杆菌及各种诱变株。 ? 生长特点：适用于糖质原料，需氧，以生物素 生长特点：适用于糖质原料，需氧， 为生长因子。 为生长因子。 ? 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、氯化钠组成的 斜面培养基：蛋白胨、牛肉膏、 pH7.0-7.2琼脂培养基 32℃培养18-24h。 琼脂培养基， 培养18 pH7.0-7.2琼脂培养基，32℃培养18-24h。 ? 2、一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢 一级种子培养：由葡萄糖、玉米浆、尿素、 二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。 二钾、硫酸镁、硫酸铁及硫酸锰组成。pH6.5-6.8。 1000ml装200-250ml振荡 振荡， 培养12h 12h。 1000ml装200-250ml振荡，32℃ 培养12h。 ? 3、二级种子培养：用种子罐培养，料液量为发酵罐投 二级种子培养：用种子罐培养， 料体积的1％，用水解糖代替葡萄糖 用水解糖代替葡萄糖， 料体积的1％，用水解糖代替葡萄糖，于32℃ 进行通 气搅拌7 10h。种子质量要求：二级种子培养结束时， 气搅拌7-10h。种子质量要求：二级种子培养结束时， 无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一， 无杂菌或噬菌体污染，菌体大小均一，呈单个或八字 排列。活菌数为10 /ml。 排列。活菌数为108-109 /ml。 三、谷氨酸发酵 ? 1、适应期：尿素分解出氨使pH上升,糖不利用。 适应期：尿素分解出氨使pH上升,糖不利用。 pH上升 4h。 2-4h。 ? 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。 措施：接种量和发酵条件控制使期缩短。 ? 2、对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上 对数生长期：糖耗快，尿素大量分解使pH上 pH 氨被利用pH又迅速下降。 pH又迅速下降 升，氨被利用pH又迅速下降。溶氧急剧下降后维 持在一定水平。菌体浓度迅速增大， 持在一定水平。菌体浓度迅速增大，菌体形态为 排列整齐的八字形。不产酸。12h。 排列整齐的八字形。不产酸。12h。 ? 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH， 措施：及时供给菌体生长必须的氮源及调节pH， pH pH7.5-8.0时流加尿素 维持温度30 时流加尿素； 30在pH7.5-8.0时流加尿素；维持温度30- 32℃ ? 3、菌体生长停止期：谷氨酸合成。 菌体生长停止期：谷氨酸合成。 ? 措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气， 措施：提供必须的氨及pH维持在7.2-7.4。大量通气， pH维持在7.2 控制温度34 34℃。 控制温度34-37 ℃。 ? 4、发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 发酵后期：菌体衰老，糖耗慢，残糖低。 ? 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 措施：营养物耗尽酸浓度不增加时，及时放罐。 ? 发酵周期一般为30h。 发酵周期一般为30h。 30h 四、谷氨酸发酵控制 ? 1、生物素：作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键 生物素： 酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在， CoA的辅酶 酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响 磷酯的合成。 磷酯的合成。 ? 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时， 谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。 形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。 ? 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖， 谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。 谷氨酸，代谢产物中乳酸和琥珀酸明显增多。 ? 2、种龄和种量的控制 ? 一级种子控制在11-12h，二级控制在7-8h。 一级种子控制在11-12h，二级控制在7 8h。 11 ? 种量为1％。过多，菌体娇嫩，不强壮，提前衰老 种量为1％。过多，菌体娇嫩，不强壮， 过多 自溶，后期产酸量不高。 自溶，后期产酸量不高。 ? 3、pH ? 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低，菌 发酵前期，幼龄细胞对pH较敏感，pH过低， pH较敏感 过低 体生长旺盛，营养成分消耗大， 体生长旺盛，营养成分消耗大，转入正常发酵 长菌不长酸。 慢，长菌不长酸。 ? 谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2，转氨酶最适 谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2， pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。 pH不变 pH 7.2-7.4。在发酵中后期，保持pH不变。过 高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。 高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。 ? 4、通风：不同种龄、种量，培养基成分，发 通风：不同种龄、种量，培养基成分， 酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。 酵阶段及发酵罐大小要求通风量不同。 ? 在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏，抑 在长菌体阶段，通风量过大，生物素缺乏， 制菌体生长。 制菌体生长。 ? 在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧，以防过 在发酵产酸阶段，需要大量通风供氧， 量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风， 量生成乳酸和琥珀酸，但过大通风，则大量积 酮戊二酸。 累a-酮戊二酸。 ? 防止噬菌体和杂菌的污染 ? 从空气过滤、培养基、设备、环境等环 从空气过滤、培养基、设备、 节严格把关。 节严格把关。 五、谷氨酸的提取 1、等电点法：操作简单，收率60％。周 等电点法：操作简单，收率60％。周 60％。 期长，占地面积大。 期长，占地面积大。 2、离子交换法：用阳离子交换树脂提取 离子交换法： 吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱， 吸附谷氨酸形成的阳离子，再用热碱洗脱， 收集相应流分，再加盐酸结晶。 收集相应流分，再加盐酸结晶。 六、谷氨酸发酵研究新进展 ? 继续选育各种生化突变菌株：转化率提高，或可在富 继续选育各种生化突变菌株：转化率提高， 含生物素的培养基中保持较高产酸水平。 含生物素的培养基中保持较高产酸水平。提高原料利 用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。 用率，拓宽原料来源或简化操作工艺。 ? 生物工程新技术的应用：体外DNA重组的基因工程和原 生物工程新技术的应用：体外DNA重组的基因工程和原 DNA 生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近1 生质体融合技术和固定化细胞技术使产量提高近1倍。 ? 改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺，通过电子 改进发酵工艺：开拓原料，改进流加工艺， 计算机控制发酵条件。 计算机控制发酵条件。 七、非糖质原料的谷氨酸发酵 ? 醋酸发酵谷氨酸 ? 机理：醋酸形成乙酰CoA，再进入TCA， 机理：醋酸形成乙酰CoA，再进入TCA， CoA TCA 因此凡能利用葡萄糖原料的菌种也可作 为醋酸发酵谷氨酸的菌株。 为醋酸发酵谷氨酸的菌株。 ? 以醋酸钠或醋酸铵与醋酸的混合液为原 且浓度不超过4％。发酵过程中也需 料，且浓度不超过4％。发酵过程中也需 流加以保持pH pH。 流加以保持pH。