我有洁癖强迫症怎么办:PCR发明前后

PCR发明前后

        自1985年PCR作为一种专利所属的生物技术登上生物学的舞台以来，迄今还没有哪一种生物技术对整个生命科学的发展产生如此深刻的影响，引物论文之多、应用范围之广。回顾这26年多的历史，也可以说是长达20多年的PCR专利法务纠纷史。所以，本文从该技术发明、发展简史和专利史等方面加以回顾。

PCR的概念

        PCR (Polymerase Chain Reaction) ，翻译成中文的全称是“聚合酶链式反应”，取名效法“原子核裂变链式反应”。其实际反应效果也是名符其实，在两个短核苷酸 (引物) 和耐热的DNA聚合酶的作用下，首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之冷却至某一温度时，引物与待扩增模板序列发上退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性－复姓－延伸的过程就是一个PCR循环，不断重复，短短数十分钟就可把靶标DNA进行2 ⁿ指数倍扩增。PCR以其高灵敏度、高效率扩增靶标DNA的特点，广泛应用于生命科学、医疗诊断、法医检测、食品卫生和环境检测等方面。Kary Mullis因发明PCR技术获得了1993年的诺贝尔化学奖，就是这个发现把生物学划分成两个明显的时代，即PCR的史前生物学时代和后现代生物学时代。PCR的发现无疑是科学技术历史上的一个范示(paradigm)。

PCR的前世

        1953年，James Watson和Crick提出DNA的结构是通过互补配对的碱基形成反方向平行的双螺旋脱氧核苷酸长链，他们依此结构进一步推测这可能暗含着遗传物质的复制机制。这需要实验来证明。事实上，差不多就在DNA双螺旋结构模型提出前后，Kornberg领导的小组就在研究DNA复制的机制，1956年他证实了DNA果然是一种能自我复制的分子并在1957年鉴定了第一个DNA聚合酶，尽管此酶功能很有限但是它打开了通往DNA复制机制研究的大门。1959年，因Kornberg发现细菌DNA复制机制和在试管中重现DNA复制过程而荣膺诺贝尔生理医学奖，1962年，Watson和Crick因DNA双螺旋结构模型也获得了诺贝尔生理医学奖。1969年，美国印第安那大学的微生物学家Thomas Brock和他的研究生Hudson Freeze从黄石国家森林公园火山温泉中发现了一种嗜热水生菌T.aquaticus (Taq)，为后来1976年Trela和他的研究生Alice Chien分离纯化到耐受>75°C热稳定Taq DNA聚合酶奠定了坚实的基础(Deoxyribonucleic Acid Polymerase from the Extreme Thermophile Thermus aquaticus)。因发现遗传密码子(genetic code)及其在蛋白质合成中的功能而获得1968年诺贝尔奖的印裔学者Gobind Khorana，他指导的博士后Kleppe等人在1971年的分子生物学杂志(Journal of Molecular Biology)原创性的发表了后来被称为PCR技术性文章，他在这篇文章这样写道，

“一个双链分子想要获得两个同样的结构，并且每个都含有包括引物在内的模板链全部碱基长度，需要加入DNA聚合酶完成这样一个修补复制过程，最后，一个原来的双链分子就产生了两个同样的双链分子。整个循环过程需要不断重复，而且每次都要添加新鲜活力的聚合酶。”

        此篇文章中这个挪位籍的小伙子Kleppe明确提出了修补复制 (repair replication) 的概念，这就是后来被学界称为PCR技术的雏形，但是在当时，测序技术并没有发明，热稳定性DNA聚合酶也没有发现，加之合成引物还只是停留在一种科学的行为艺术，所以这个想法很快被学界忘记在一边。好的思想就像一束火花，而散落的火星总是无意间引燃一个火种。事实上，这篇文章的工作早在1969年在新罕布什尔州 (New Hampshire)举行的高登会议上(Gordon Conference)，Kleppe就向与会者描述了一个双链DNA分子产生两个同样结构的双链分子技术，而高登会议(Gordon Conference)则是美国学术界的每年一次的“华山论剑”。值得一提，当时在场的听众中有一位叫Stuart Linn的教授，在他随后的教学中按照Kleppe描述并使用反应组成物演示了这个试验，这些听课的学生中有一位叫Karry Mullis，是他接过PCR研究的接力棒完成了最终冲刺。普罗米修斯因偷盗阿波罗太阳神的火种虽永受折磨但世受尊重，相比之下，Karry Mullis因发明PCR幸运的获得1993年诺贝尔奖，不幸的是也因此殊荣遭受了非议。人类学家Paul Rabinow曾在1996年撰写了一本关于PCR历史的书《Making PCR: a story of biotechnology》，公开质疑Mullis到底是PCR发明者，还是“仅仅”追随了这个概念。

PCR的分娩

        历史的车轮缓慢而执著的向前碾来。1979年，Sanger在《美国科学院院刊》PNAS上发表了题为“链末端终止DNA测序法”的文章，此项方法学的文章中使用了寡核苷酸引物，DNA聚合酶和能终止反应引物延伸的、修饰过的核酸，短短三年后，1980年Sanger再次因发明此“桑格法”核酸测序而获得诺贝尔奖，其后改进的自动化桑格测序法成就了多国联合开展的“人类基因组学计划”。所以， 1980年的时候，差不多到学界都知道通过DNA聚合酶引物延伸可以进行DNA测序和逆转录cDNA用于克隆和表达，更重要的是，DNA聚合酶的缺口平移(nick translation)用于Southern blotting的探针标记，这种DNA杂交检测可以用于目标DNA片段的半定量检测。一切都孕育并暗示着PCR技术方法的即将降临人世，就等一个人的登场，他就是Karry Mullis博士。1972年，28岁的Karry Mullis获得了加州大学伯克利分校生物化学系的博士学位，但是六年来的博士研究他实际上并没有发表一篇和生化相关的的论文，而是1968年在Nature杂志上发表了一篇《时间反演的宇宙学意义》 ("The Cosmological Significance of Time Reversal") 的论文，因为有这样一篇论文帮助Mullis拿到PhD博士学位，当然这也要归功于他导师Joe Neilands教授宽松开明的行事风格。毕业后Mullis随他的妻子到了堪萨斯州，在那里的一个医学院谋到了一份科研工作，即该校医学院小儿心脏病室继续从事生化研究工作。婚姻破裂后，他回到旧金山后，由于没有固定的工作，他先是在前任妻子经营的一家餐馆打零工，闲暇之余也写写科幻故事，后来并在朋友的介绍下到加州大学一神经化学实验室从事宰杀实验老鼠的工作。1979年秋天，Mullis终于有了一份固定的工作，应聘到一家生物公司Cetus负责合成DNA，不到20nt长度的DNA片段，供公司内部其它部门研发使用。两年后，他成为公司DNA合成实验室的负责人。Mullis后来轻松的回忆，由于自动化作业，他所在的部门生产了大量核苷酸片段以至于冰箱都没有空间来存放，而部门工作人员则悠闲而无所事事。

        不是所有的学者都像Mullis那么行事随意，愿意从学术单位转而供职于一家商业公司的。1976年，成立刚满5年的Cetus公司求贤若渴，好说歹说把Gelfand David博士从加州大学伯克利分校请到公司负责重组DNA部门，当时DNA重组技术是最惹人眼的明星技术，也符合当时Cetus公司三大技术发展方向之一。这为Cetus公司在1981年IPO融得1亿美金的注资，创造了当时首次公开募股IPO最佳历史记录。Gelfand虽然没有在大学谋到教授，但是他赢得了同事半开玩笑的美誉“生物技术民间英雄”。但事实上，Gelfand所作的研究工作不亚于大学教授的工作，他有多篇文章发表在Science等一流杂志上，为Cetus公司他的雇主挣到了很多个盈利性的专利，当然，这些为若干年后的官司诉讼埋下了伏笔。很明显，在Mullis进入Cetus公司前后，Cetus公司因有像Gelfand David这样科学家而形成了一个兼容并蓄的研究氛围，这个环境很好的接纳了Mullis，并成为其研究创作的土壤。值得一提的是，Cetus公司最初的四个创始人之一Don Glaser因发明探测高能带电粒子径迹的“泡室”获得过1960年的诺贝尔物理学奖，他一度担任该公司的技术总监。所以，有这样的科学明星掌舵，Cetus公司不乏能人云集。

        上班不忙，Mullis开始有时间琢磨他生产出来的核苷酸片段变性、复性的特性，不断实验，还摸索出一个定量计算公式，他依此推端如果能够指数增长，那么将成为快速获得大量DNA片段的一种强有力工具。1983年5月的一个夜晚，Mullis和他的公司同事也是他的女友Jennifer驱车从旧金山开往Mendocino县，一路蜿蜒盘旋迂回的公路让他灵感突现，能不能实现无限扩增DNA片段？既然用机器批量合成核苷酸片段并不难，能否在反应中加两条引物而不是一条引物，这样一条引物可以结合到正义链，另一条引物则结合到负链，如果一个循环接着一个循环重复做，那么会有怎样的结果？每次循环都会得到两倍于上次循环的DNA量。EUREKA!!!!Mullis将车停靠在128高速公路一旁，迅速取出笔和纸又演算了一遍，2的10次方次循环可以扩增到1000倍的量，2的20次是100万倍，2的30次是1亿倍！Mullis终于找到了通往PCR扩增折扇大门的钥匙，他当天晚上为此兴奋的彻夜未眠！熬到周一，Mullis赶紧跑到图书馆做文献检索，一方面是看是否有类似想法工作的文章发表。另外一方面，毕竟Mullis的老底子还是搞有机化学和合成的，他当时不能确定他的想法是否一定有理论可行性。一周后，他把这个想法和公司同事分享，让他惊讶的是，没有一个人和他为此一样激动，因为Mullis的奇思怪想太多了，他的同事并没有觉得这次有什么高明之处。况且，差不多每个人都知道用一个引物可以延伸扩增DNA模板，每个人都知道双链DNA可以变性复性。但是，大家还是没有否定这个想法，觉得可以尝试一下。但Mullis并没有急于第一次尝试，而是找公司内外的专家交换意见。作为公司的研究科学家，他在两年一次例行汇报会上报告了这个想法，遗憾的是，反应冷淡，公司的研发科学家要么没等他讲完就离开，要么缄口不做任何评论，仅有1-2个实验员比较感兴趣，其中一个是他的女友Jennifer支持这个想法，此事Mullis更能体会“知音难觅”。他首先尝试扩增一个400bp的人类神经生长因子基因，因为这个目标片段序列Genetech公司已经克隆并发表在Nature杂志上，而合成所需的DNA引物，对于Mullis而言只是举手之劳。把所有反应组分模板DNA、引物和10U的DNA聚合酶放到塑料管中，盖上盖子放置在37°C，12小时后，加EB跑胶，没有任何结果。失败是显然的，Mullis在第一次实验并没有意识到需要一遍又一遍的加热－降温－补加聚合酶过程，而是理论的认为DNA:DNA的互作是可逆，即使在扩增反应中也是如此。而且，他也没有思考反应发生的时间，从化学反应的角度只要符合准一级反应动力学，引物浓度足够高，那么形成单链模板的浓度会是无穷大。Mullis本可加紧优化改进PCR实验，不料与此同时，和想恋两年的女友Jennifer翻脸分手，使得此项工作进展缓慢，从这次实验后有过了三个月，Mullis觉得没有必要选择扩增人的基因，直接扩增质粒pBR322的一个片段即可。这次他成功了，时间是1983年12月16日。这一天距离他获得灵感过去了整整大半年，Rabinow在他的书中说，Mullis搁置长达数月才来验证他的想法，要么说明Cetus公司如火如荼的工作节奏根本让Mullis无暇顾及，要么说明Mullis陷入没完没了的恋爱之中，还有一种可能就是来自同事们的怀疑和不支持。

        1984年6月，公司在加州的Monterey举行年会，总结阶段性研究结果和制定发展规划，Mullis在会上又一次展示了他的PCR结果，遗憾的是，只有Cetus公司的一个科学顾问对此比较感兴趣。也就是在这个会上，Mullis和另外一位同事发生口角最后上升到肢体接触，最终的结果是这位同事离开了公司而Mullis降职留用，这件事情后来成为Mullis离开Cetus公司的导火线。三个月后，Cetus公司的一位分管公司研发的副总Tom White，与Mullis私交不错，让他带领一个小组从事DNA突变的试验，颇有一点让他“戴罪立功”的味道。这样又经过几个月的反复试验，但是不怎么顺利，结果只能说明PCR能扩增基因组DNA，但是扩增产物跑琼脂糖凝胶电泳没有任何条带，这让大家很是泄气，因为这样的结果不能说明PCR能扩增出目的片段。这样沮丧悲观的情绪一直持续到11月，该组有人提议用Southern blotting方法来检测DNA目标片段，通过放射自显影才发现了110bp的片段，进而把这个110bp的片段克隆出来并测序，证明了就是要扩增的目的片段，但是同时也发现这种复制扩增过程也引入了几个不正确的碱基，无论如何，这个结果给他们带来了胜利的曙光！过往圣诞节，差不多是在1985年春天，该小组又试着用PCR扩增其它基因目的片段HLA DQα，扩增特异性要远远好于扩增的110bp的β-血红蛋白，在凝胶电泳图上清晰的呈现出PCR扩增条带，这次PCR扩增非常成功！早在1983年的那个晚上Mullis就敏锐的把握到PCR将会改写分子生物学的历史，他直接找到首席专利事务专员Halluin要求申请一个专利加以保护。Halluin本人从事生物专利工作经验丰富，马上认识到PCR技术的重要性，这个方法可以在较短的时间内大量扩增同一个分子量的DNA分子，其扩增过程模拟了生物体内核酸扩增，他为此马上起草了专利申请书，最终在1985年3月25日拿到专利批复，这就是后来一分为二的两个PCR专利号4, 683,202和4, 683,195，这时距Mullis灵感乍现已经差不多又过去了两年。

       1985年的春天，PCR扩增HLA DQα虽然获得了成功，但是，他们发现其实这个扩增反应还是很花费人力的。需要一个专职人员站在一旁，等每一轮变性后立即添加新鲜活力的DNA聚合酶，以保证反应能继续进行。能不能能耐受变性的高温又保持聚合酶活性的DNA聚合酶呢？Mullis又一次先知卓见的指出从耐热菌中分离！碰巧，Cetus公司隔壁实验室就有一株能耐受100°C高温的菌Thermophilus aquaticus (Taq)，隔壁实验室用它分离纤维素酶降解纤维素。但是，由于Mullis不擅长蛋白纯化方面的实验，由于各部工作繁忙最后几经内部推诿磋商，推给了由前文提到的蛋白重组专家Gelfand David博士领导负责完成，主要参与者是Stoffel Susanna，他们1985年的秋季纯化出热稳定性Taq聚合酶，因其巨大的商业利益，Cetus公司也申请并获得了专利 (US patent 4,889,818)，其后在1988年Science上公开发表了这项成果。Taq酶的发现，使得PCR真正变为现实，为PCR的自动化铺平了道路。1989年，《Science》杂志将热稳定DNA聚合酶命名为 “年度分子”。

Erlich, Henry A. (ed.) (1989) PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (New York: Stockton Press).