偶看新闻《品味人生》读后感:染色方法总结 - 免疫学技术讨论版 -丁香园论坛
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/05/06 10:19:30
A
AgNOR染色法:
1、试剂配制：
（1）AgNOR染色液：
甲液：明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml，在60℃使之完全溶解，再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。
乙液：硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml，4℃冰箱保存。
（2）AgNOR工作液
取甲液10 ml，乙液20 ml 临用前混合。
2、步骤：
（1）切片脱蜡至水
（2）双蒸水洗2次
（3）AgNOR 工作液中（25℃）浸染30分钟（暗处进行）（镜下观察）
（4）双蒸水洗3次
（5）脱水,透明,封固
3、结果：油镜观察，细胞核及胞质背景为淡黄色， AgNOR呈棕黑色颗粒状。
B
鞭毛染色法:
１．试剂配制：
甲液：丹宁酸 ５克
氯化铁（ＦｅＣｌ3） １．５克
福尔马林（１５％） ２．０毫升
氢氧化钠（ＮａＯＨ）１％ １．０毫升
乙液：硝酸银（ＡｇＮＯ3） ２克
蒸馏水 １００毫升
制备乙液时，待硝酸银溶解后，取出１０毫升备用，向余下的９０毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，先呈很浓厚的沉淀，再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中，先呈现薄雾，但轻摇则消失，继续边滴加边摇动，待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。如雾重，则银盐沉淀，不宜使用。
２．染色方法：
（１）将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上，置３７°培养１６—２０小时，备用。
（２）在载玻片的中部相隔一厘米处，用接种环各沾一滴蒸馏水，然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中，倾斜玻片使培养物流至另一水滴中，两水滴自然相通，菌体从上位自然扩散到下位水滴中，待干燥后染色。
（３）在干燥涂片上加甲液３—５分钟，用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后，加适量乙液保持３０—６０秒钟。染色时在酒精灯上稍加热，使染液出现蒸汽即可，用蒸馏水冲洗。
（４）镜检：菌体及鞭毛皆染成茶色。
３．注意事项：
（１）染液最好随用随配，存放至次日效果则差。
（２）一定要充分洗净甲液后再加乙液，否则背景较脏。
（３）防止水及培养物沾有氯化物。
（４）切忌用接种环涂抹培养物。
（５）载玻片一定要洗净。先用洗衣粉煮沸，再水洗，干后放在洗液中，浸泡２４小时，取出水洗除去残酸，沥干，存放于９５％乙醇中备用。
（６）加热时最好置金属板上，使载玻片受热均匀。
β－半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解为单糖：葡萄糖和半乳糖。
β－半乳糖苷酶的活性可以用X-gal（5-溴－4-氢－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）等显色底物加以检测，β－半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性的深蓝色沉淀。
X-gal可以做为组织染色剂，可以在所有表达β－半乳糖苷酶的植物和动物组织上产生颜色。
应该是可以用来病毒感染组织切片染色的。
C
CAE染色步骤
1、试剂配制：
（1）A液：萘酚-AS—D氯醋酸10mg溶于N,N-二甲基甲酰胺1ml中。
（2）4％副品红液：取盐酸副品红(EM级)1g，溶于蒸馏水20ml内，再加入10m1／L的HCl 5m1，稍加温以增加溶解度，过滤、贮室温下。于使用前，取等量副品红液与新鲜的4％亚硝酸钠混合，之后用淀粉碘化物试纸测试，瞬间试纸应变为蓝色才合格，如果不变色，应加入更多的亚硝酸盐。
（3）B液：o．1mol/L的Michaelis Veronal-醋酸缓冲液(PH 7.6)30ml，加入新配制的副品红液3滴，用1moI／L HCl使PH值调至6．3。
2、染色步骤：
（1）将A.、B二液混合，过滤，加入氟化钠(17mg/10ml), 使之最后浓度为0.04mol/L.
（2）切片置于上述溶液内孵育1h(30℃)
（3）流水冲洗。
（4）苏木素复染。
（5）空气干燥后封固。
G
Grimelius硝酸银反应法（嗜银反应）:
1、试剂配制：
硝酸银液: 1%硝酸银水溶液 3毫升 蒸馏水 87毫升
0.2M醋酸缓冲液(PH5.6) 10毫升
还原液: 对苯二酚 1克 亚硫酸钠 5克 蒸馏水 100毫升
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水
（2）60℃硝酸银液内3小时
（3）用滤纸吸去周围银液,蒸馏水速洗
（4）入45℃的还原液处理1分钟
（5）蒸馏水洗
（6）5%硫代硫酸钠处理1 分钟(可不做)
（7）水洗,脱水,透明,封固
3、结果：嗜银颗粒呈棕黑色。正常时嗜银颗粒存在于神经内分泌细胞，故此法主要用于神经内分泌肿瘤的诊断。
H
HID染色法1、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水
（2）放入预热的1当量盐酸中10分钟
（3）蒸馏水洗
（4）Schiff液中染10分钟
（5）自来水洗15分钟至细胞核红色（如2～5步不做，可在染好爱先蓝后染核固红2分钟）
（6）蒸馏水洗
（7）高铁二胺液 18～24 小时
（8）爱先蓝液(pH2.5)染10～20分钟
（9）蒸馏水洗
（10）脱水,透明,封固
2、结果: 硫酸化酸性粘液呈棕黑色,羧基化酸性粘液（唾酸粘液）物质蓝色。硫酸化酸性粘液可见于大肠粘膜，而小肠粘膜仅出现唾酸粘液，此法多用于确定肠化的分型。
HP（硝酸银法）
1、试剂配制：
（1）醋酸缓冲贮备液，PH3.6
0.2N醋酸缓冲液，PH3.6 10 ml
蒸馏水 240 ml
以下各液均用此液配制
（2）1 %硝酸银液
硝酸银 1 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml
（3）2 %硝酸银液
硝酸银 0.2 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml
（4）5 %明胶液
明胶 5 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml
先把醋酸缓冲贮备液加温至40℃左右，然后倾入明胶，于37℃温箱内慢慢溶解，搅
拌。
（5）3 %对苯二酚液
对苯二酚 0.3 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml
（6）明胶对苯二酚液
3 %对苯二酚液 1 ml
5 %明胶液 15 ml
（7）显影液
明胶对苯二酚液 16 ml
2 %硝酸银液 3 ml
在操作到第4步完成前5分钟充分混合，置于56℃水浴箱中保温待用。
2、操作方法：
（1）组织脱蜡至蒸馏水
（2）醋酸缓冲贮备液洗2次
（3）入1 %硝酸银液中，56℃，1小时
（4）切片不水洗，直接放入预热的显影液中56℃，肉眼呈黄棕色为止。
（5）倾去显影液，于56℃的水中浸洗2分钟
（6）水洗
（7）脱水，透明，封固。
3、结果：幽门弯曲菌呈棕黑至黑色。
Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）
1、试剂配制：
甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml
碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至水
（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟
（3）用碱性乙醇分化液分化数秒
（4）水洗
（5）苏木素复染2分钟
（6）水洗
（7）脱水,透明,封固
3、结果：淀粉样物呈桔红色。
4、类淀粉染色的应用：
确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，常用于诊断甲状腺髓样癌和胰岛细胞瘤等。
L
六胺银染色法1、试剂配制：
六胺银液配制：
3%六次甲基四胺水溶液 5 ml
2.5%硝酸银水溶液 0.5 ml
摇晃，变清，再加2.5%四硼酸钠1.5~2 ml加蒸馏水至30~40 ml
2、步骤：
（1）切片脱蜡至水，蒸馏水洗
（2）0.5%高碘酸浸15分钟，蒸馏水洗
（3）六胺银液60℃，1-2小时，（或六胺银液80-90℃，半小时左右）蒸馏水洗（镜下基底膜呈黑色）
（4）0.2% 氯化金调色数秒
（5）丽春红淡染
（6）水速洗
（7）烘干，透明，封片。
3、结果：肾小球基底膜呈黑色，霉菌，弹力纤维及一些网状纤维也呈黑色。
M
Mallory 三色法1、步骤
（1）切片脱蜡至水
（2）0.5%酸性复红水溶液1 min
（3）蒸馏水洗
（4）入下液1-2min
苯胺蓝0.5g，桔黄G 2g，磷目酸或磷钨酸 1g，蒸馏水100ml。
（5）蒸馏水洗
（6）95%乙醇分色
（7）脱水，透明，封片。
2、结果：胶原纤维蓝色， 红细胞桔黄色，核红色。
Mallory磷钨酸～苏木素染色法（PTAH）
1、试剂配制：
苏木素 0.1 g 磷钨酸 2.0 g 蒸馏水 100 ml
先将苏木素加热溶于20毫升蒸馏水,再将磷钨酸溶于80毫升蒸馏水。等苏木素冷却后，加入磷钨酸溶液，混合，放置数星期后，才可使用。如急用，可加入0.2 g高锰酸钾,加速其成熟。
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水。
（2）放入0.25%高锰酸钾水溶液5分钟。
（3）蒸馏水洗。
（4）2.5%草酸漂白5分钟。
（5）蒸馏水洗多次。
（6）置于磷钨酸苏木素溶液12～24小时。
（7）95%酒精快速分化，滤纸吸去剩余酒精，置60℃温箱中烘干。
（8）二甲苯透明，封固。
3、结果：纤维胶质，肌胶质，神经胶纤维，纤维素，横纹肌等均染成蓝色。胶原，网状纤维和骨基质着黄色或砖红色。在工作中常用于观察横纹以证实肿瘤细胞是否有横纹肌分化特征。
Masson 三色染色法、
1、试剂配制：
丽春红酸性品红液： 丽春红 0.7 g 酸性品红 0.3 g
蒸馏水 99ml 冰醋酸 1 ml
苯胺蓝液: 苯胺蓝 2 g 蒸馏水 98 ml 醋酸 2 ml
亮绿液： 亮绿 0.2g 蒸馏水 100 ml 冰醋酸 0.2 ml
苦味酸酒精液:苦味酸在95%酒精中的饱和液 20 ml,加95%酒精10 ml
2、染色步骤：
（1）切片脱蜡至蒸馏水
（2）苏木素染5～10分钟
（3）盐酸酒精分化
（4）流水蓝化，蒸馏水洗(苏木素可不染)
（5）丽春红酸性品红液中染5～8分钟
（6）蒸馏水洗
（7）1% 磷钼酸中染1～3分钟
（8）不用水洗直接入苯胺蓝液或亮绿液5分钟 (如染色效果不佳,可在冰醋酸内脱色后重染)
（9）水速洗，置60℃温箱中烘干，二甲苯透明,封固
3、结果:胶原纤维蓝色（苯胺蓝复染）或绿色（亮绿复染）,肌纤维、纤维素红色。
4、注意：
（1） 此法广泛用于胶原纤维和平滑肌的鉴别，也为肾组织活检，观察肾小球病变的重要染色法，常用于观察缺血病变的心肌。 用于观察肾小球病变时，一定要用2um以下半薄切片。
（2） 细胞核染色后分化很重要，观察控制着色程度。而HE染色则是最常用的一种常规染色方法，但无法区别胶原纤维和肌肉。
N
粘液染色
（一）PAS染色法
与染糖元的方法相同。
（二）AB(pH2.5)染色法
1、试剂配制：
爱先蓝8GX 1 g 蒸馏水 97 ml 冰醋酸 3 ml
核固红液: 核固红 0.1g 硫酸铝 5g 麝香草酚 50mg 蒸馏水 97ml
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水。
（2）爱先蓝液染10～20分钟
（3）蒸馏水洗
（4）核复染(核固红5分钟)，水洗
（5）脱水,透明,封固。
唾液酸及弱硫酸化粘液及一般粘液呈蓝色。常用于确定胞浆内空泡的性质，特别是当细胞呈现印戒样特征时。
J
甲基绿派洛宁法（改良Cook，1974）
1、试剂配制：
（1）2%甲基绿水溶液：
甲基绿（methyl green）1g
蒸馏水加至50ml
用三氯甲烷抽提，方法详后。
（2）5%派洛宁水溶液：
派洛宁G（pyronine G）1g
蒸馏水加至20ml
（3）0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8）
0.2M醋酸液41ml
0.2M醋酸钠液59ml
（4）甲基绿派洛宁染液：
2%甲基绿水溶液（经抽提） 5ml
5%派洛宁水溶液 1ml
蒸馏水 12ml
0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8） 18ml
甲基绿水溶液的抽提：甲基绿为绿色粉末，属三苯甲烷染料，这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一种化合物。由于甲基化作用，甲基绿就比甲基绿后，所引进的甲基连接得并不牢固，容易从甲基绿中脱失。另一方面，在甲基化过程中，还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿，因此，也有人认为甲中，常有少量的甲基紫或结晶紫成份。但是，也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物，甲基绿在储存过程中，会不断产生甲基紫。因此，在配制试剂时，必须先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来，才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色。抽提方法是取2%甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，加入三氯甲烷20ml充分摇荡混合，使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把如此反复更换三氯甲烷，直到三氯甲烷无紫红色为止，即可得到得纯的甲基绿溶液。
2、操作步骤：
（1）新鲜组织固定于Carnoy氏液（4℃）3~6小时，经95%酒精和无水酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
（2）切片经二甲苯脱蜡至蒸馏水。
（3）置入甲基绿派洛宁染液于室温染30~60分钟。
（4）取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。
（5）用丙酮迅速分化。
（6）转入丙酮二甲苯（1:1）稍洗。
（7）二甲苯透明2~3次。
（8）中性树胶封固。结果：存在于胞质和核仁内的核糖核酸呈红紫色，胞核染色质内的脱氧核糖核酸绿色或绿蓝色。
3、对照方法：
（1）取另一连续切片用核糖核酸酶（rihonuclease）1mg/1ml于37℃温箱内消化3小时，蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。
（2）切片在10%高氯酸（prechloric acid）于4℃处理12~18小时，水洗后用1%碳酸钠液中和2分钟，流水冲洗5分钟，再用蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。经上述方法之一处理后的切片就为阴性。
4、注意事项：
（1）组织不宜用甲醛固定，应选用Garnoy氏固定液，因为酒精和醋酸能较好地保存核蛋白。
（2）Garnoy氏液固定标本的时间不宜太长，超过一天则染色效果不理想。
（3）要注意试剂的质量，特别是派洛宁，常常不同批号的染料，染色的效果不同。甲基绿和派洛宁二者的比例要恰当。
（4）染色液的pH应为4.8左右，如pH过低，甲基绿染色效果差；pH偏高，则派洛宁染色效果不良。
（5）丙酮分化时间要很好掌握，时间不宜太长。
（6）配妥的甲基绿派洛宁染液用后放冰箱保存，约可使用数周。
染色原理：对此法的染色原理，目前了解得还不够清楚，一般可从下面两方面理解。1、电离作用：脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基，又有碱基，故为两性电解质。在一定的条件下，可以电离而带电荷，因此都有一定的等电点。甲基绿和派洛宁在水中电离后，都产生带阳电荷的离子。甲基绿电离后，在五价氮处产生二个正电荷，碱性较强。派洛宁电离后仅产生一个正电荷，碱性较甲基绿弱，在染色时二者进行竞争，碱性较强的甲基绿就与胞核（等电点pH3.8~4.2）进行极性吸着而结合，碱性较弱的派洛宁与胞质（等电点pH4.6~5.2）吸附结合。2、聚合作用：甲基绿对聚合高的DNA有亲和力，派洛宁对聚合低的RNA有亲和力。因此，思虑在绿选染DNA，而派洛宁选染RNA。应用：PNA主要存在于胞质及核仁内，它主导细胞的蛋白质合成。在细胞增生，胞质蛋白质合成亢进时，核仁和胞质的PNA增加。因此，恶性瘤细胞核仁巨大，胞质嗜碱。浆细胞和免疫母细胞胞质合成免疫球蛋白，胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此，这些细胞胞质有很强的嗜碱性。胞质嗜碱，是蛋白质合成增强的标志。
S
脂肪（苏旦Ⅲ）法
1、试剂配制：
苏旦Ⅲ 0.1～0.2 70% 酒精 100 ml
将苏旦Ⅲ置于70%酒精中,加热饱和,在未冷前过滤,静置一夜。
2、染色步骤：
（1）冰冻切片（8～10微米）。
（2）70%酒精固定1分钟。
（3）放入苏旦Ⅲ酒精溶液中20～30分钟。
（4）70%酒精洗去多余的染料。
（5）水洗。
（6）苏木素复染2～5分钟。
（7）1%盐酸酒精分化。
（8）水洗，蓝化,甘油封固。
3、结果：脂肪桔黄或红色。一般用于确定胞浆内空泡究竟是糖原，水变性还是脂滴。
P
高碘酸-六胺银-马休黄染色法(PASM-M)
1、试剂配制：
六胺银原液： 3 %六甲基四胺水溶液(乌洛托品) 20 毫升，5 %硝酸银水溶液 10 毫升。
六胺银工作液：六胺银原液30毫升，双蒸水 20毫升，5 %硼砂(四硼酸钠)2毫升。
核固红液：核固红0.1 克，5 %硫酸铝100毫升加热溶解，贮存饱和液待用。
马休黄液：马体黄 0.5 克，无水酒精 98 毫升，磷酸 0.2 克。
2、操作方法：
（1）常规脱蜡至水
（2）0.5%氧化20分钟
（3）蒸馏水洗3次
（4）浸入六胺银工作液中2小时左右(恒温58℃)
（5）蒸馏水洗3次
（6）0.2%氯化金1-2分钟
（7）蒸馏水洗2次
（8）核固红染色10-15分钟
（9）马休黄染色1分钟
（10）放入温箱烤干，二甲苯透明，中性树胶封固
3、结果：肾小球毛细血管基膜呈黑色，背景和红细胞呈黄色，细胞
核呈红色。
4、注意： 1、六胺银工作液现配现用，只能用一次。
2、第3步做完后可入5 %三氧化铬(铬酸)水溶液氧化40 分
钟，再用1 %亚硫酸钠除铬，背景可能效果更佳。
3、马休黄主要是染红细胞。用无水酒精中脱水，黄色的背景就脱掉，可直接放入
温箱或电吹风吹干，封片。
R
瑞氏－姬姆萨染色方法
1、试剂配制：
原料:A:瑞氏染粉0.8--1克；吉姆萨染粉0.5克
B:甘油33ml
C：甲醇500ml
配法：将A放入研钵中，加入少量B研磨，再加入少量B磨，再加入少量B磨……倒出，将未溶部分，继续加入B磨……>全溶，加入C，或中间加入C 亦可。
2、染色步骤：
滴数滴入玻片盖满标本，30秒，再加入双蒸水或PBS2-3倍染1-3分中，倾去染液，水洗……封片。
T
Trypan blue （台盘兰）排斥实验：
细胞悬液0.1ml加入0.4% Trypan blue生理盐水溶液0.1ml,混匀后滴在血球记数板上。存活率=不着色细胞数/细胞总数X100%
TTC方法：
TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲月赞，用来表示细胞的活力。配制多为2％，染色要避光，37度条件下，它是评价脑缺血损伤常用的指标。
V
Van Gieson法 1、试剂配制：
饱和苦味酸水溶液（约1.22%） 150 ml
1%酸性品红 10 ml
两种溶液用前混合在一起。
2、染色步骤：
（1）切片脱蜡至蒸馏水。
（2）苏木素深染。（10～15分钟）
（3）Van Gieson中染半分钟。
（4）蒸馏水洗。
（5）置60℃温箱中烘干。
（6）二甲苯透明，封固。
3、结果：胶原纤维红色，肌纤维、胞浆、红细胞黄色。
4、建议：用稀释的Van Gieson液进行染色，不用95%的酒精分化，结果色泽鲜艳，而且着色均匀。
AgNOR染色法:
1、试剂配制：
（1）AgNOR染色液：
甲液：明胶2 g 溶于双蒸水至99 ml，在60℃使之完全溶解，再加入纯甲酸1 ml 摇匀待用。
乙液：硝酸银50 g 溶解于双蒸水中至100 ml，4℃冰箱保存。
（2）AgNOR工作液
取甲液10 ml，乙液20 ml 临用前混合。
2、步骤：
（1）切片脱蜡至水
（2）双蒸水洗2次
（3）AgNOR 工作液中（25℃）浸染30分钟（暗处进行）（镜下观察）
（4）双蒸水洗3次
（5）脱水,透明,封固
3、结果：油镜观察，细胞核及胞质背景为淡黄色， AgNOR呈棕黑色颗粒状。
B
鞭毛染色法:
１．试剂配制：
甲液：丹宁酸 ５克
氯化铁（ＦｅＣｌ3） １．５克
福尔马林（１５％） ２．０毫升
氢氧化钠（ＮａＯＨ）１％ １．０毫升
乙液：硝酸银（ＡｇＮＯ3） ２克
蒸馏水 １００毫升
制备乙液时，待硝酸银溶解后，取出１０毫升备用，向余下的９０毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵，先呈很浓厚的沉淀，再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中，先呈现薄雾，但轻摇则消失，继续边滴加边摇动，待澄清液呈现略有轻微不消散的薄雾状为止。如雾重，则银盐沉淀，不宜使用。
２．染色方法：
（１）将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上，置３７°培养１６—２０小时，备用。
（２）在载玻片的中部相隔一厘米处，用接种环各沾一滴蒸馏水，然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中，倾斜玻片使培养物流至另一水滴中，两水滴自然相通，菌体从上位自然扩散到下位水滴中，待干燥后染色。
（３）在干燥涂片上加甲液３—５分钟，用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后，加适量乙液保持３０—６０秒钟。染色时在酒精灯上稍加热，使染液出现蒸汽即可，用蒸馏水冲洗。
（４）镜检：菌体及鞭毛皆染成茶色。
３．注意事项：
（１）染液最好随用随配，存放至次日效果则差。
（２）一定要充分洗净甲液后再加乙液，否则背景较脏。
（３）防止水及培养物沾有氯化物。
（４）切忌用接种环涂抹培养物。
（５）载玻片一定要洗净。先用洗衣粉煮沸，再水洗，干后放在洗液中，浸泡２４小时，取出水洗除去残酸，沥干，存放于９５％乙醇中备用。
（６）加热时最好置金属板上，使载玻片受热均匀。
β－半乳糖苷酶可以催化二糖乳糖水解为单糖：葡萄糖和半乳糖。
β－半乳糖苷酶的活性可以用X-gal（5-溴－4-氢－3－吲哚－β－D－半乳糖苷）等显色底物加以检测，β－半乳糖苷酶可将X-gal转变为不溶性的深蓝色沉淀。
X-gal可以做为组织染色剂，可以在所有表达β－半乳糖苷酶的植物和动物组织上产生颜色。
应该是可以用来病毒感染组织切片染色的。
C
CAE染色步骤
1、试剂配制：
（1）A液：萘酚-AS—D氯醋酸10mg溶于N,N-二甲基甲酰胺1ml中。
（2）4％副品红液：取盐酸副品红(EM级)1g，溶于蒸馏水20ml内，再加入10m1／L的HCl 5m1，稍加温以增加溶解度，过滤、贮室温下。于使用前，取等量副品红液与新鲜的4％亚硝酸钠混合，之后用淀粉碘化物试纸测试，瞬间试纸应变为蓝色才合格，如果不变色，应加入更多的亚硝酸盐。
（3）B液：o．1mol/L的Michaelis Veronal-醋酸缓冲液(PH 7.6)30ml，加入新配制的副品红液3滴，用1moI／L HCl使PH值调至6．3。
2、染色步骤：
（1）将A.、B二液混合，过滤，加入氟化钠(17mg/10ml), 使之最后浓度为0.04mol/L.
（2）切片置于上述溶液内孵育1h(30℃)
（3）流水冲洗。
（4）苏木素复染。
（5）空气干燥后封固。
G
Grimelius硝酸银反应法（嗜银反应）:
1、试剂配制：
硝酸银液: 1%硝酸银水溶液 3毫升 蒸馏水 87毫升
0.2M醋酸缓冲液(PH5.6) 10毫升
还原液: 对苯二酚 1克 亚硫酸钠 5克 蒸馏水 100毫升
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水
（2）60℃硝酸银液内3小时
（3）用滤纸吸去周围银液,蒸馏水速洗
（4）入45℃的还原液处理1分钟
（5）蒸馏水洗
（6）5%硫代硫酸钠处理1 分钟(可不做)
（7）水洗,脱水,透明,封固
3、结果：嗜银颗粒呈棕黑色。正常时嗜银颗粒存在于神经内分泌细胞，故此法主要用于神经内分泌肿瘤的诊断。
H
HID染色法1、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水
（2）放入预热的1当量盐酸中10分钟
（3）蒸馏水洗
（4）Schiff液中染10分钟
（5）自来水洗15分钟至细胞核红色（如2～5步不做，可在染好爱先蓝后染核固红2分钟）
（6）蒸馏水洗
（7）高铁二胺液 18～24 小时
（8）爱先蓝液(pH2.5)染10～20分钟
（9）蒸馏水洗
（10）脱水,透明,封固
2、结果: 硫酸化酸性粘液呈棕黑色,羧基化酸性粘液（唾酸粘液）物质蓝色。硫酸化酸性粘液可见于大肠粘膜，而小肠粘膜仅出现唾酸粘液，此法多用于确定肠化的分型。
HP（硝酸银法）
1、试剂配制：
（1）醋酸缓冲贮备液，PH3.6
0.2N醋酸缓冲液，PH3.6 10 ml
蒸馏水 240 ml
以下各液均用此液配制
（2）1 %硝酸银液
硝酸银 1 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml
（3）2 %硝酸银液
硝酸银 0.2 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml
（4）5 %明胶液
明胶 5 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 100 ml
先把醋酸缓冲贮备液加温至40℃左右，然后倾入明胶，于37℃温箱内慢慢溶解，搅
拌。
（5）3 %对苯二酚液
对苯二酚 0.3 g
醋酸缓冲贮备液，PH3.6 10 ml
（6）明胶对苯二酚液
3 %对苯二酚液 1 ml
5 %明胶液 15 ml
（7）显影液
明胶对苯二酚液 16 ml
2 %硝酸银液 3 ml
在操作到第4步完成前5分钟充分混合，置于56℃水浴箱中保温待用。
2、操作方法：
（1）组织脱蜡至蒸馏水
（2）醋酸缓冲贮备液洗2次
（3）入1 %硝酸银液中，56℃，1小时
（4）切片不水洗，直接放入预热的显影液中56℃，肉眼呈黄棕色为止。
（5）倾去显影液，于56℃的水中浸洗2分钟
（6）水洗
（7）脱水，透明，封固。
3、结果：幽门弯曲菌呈棕黑至黑色。
Highman甲醇刚果红染色法（类淀粉染色）
1、试剂配制：
甲醇刚果红染液: 刚果红 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml
碱性乙醇分化液: 氢氧化钾 0.2 g 80%乙醇 100 ml
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至水
（2）甲醇刚果红染液染10～20分钟
（3）用碱性乙醇分化液分化数秒
（4）水洗
（5）苏木素复染2分钟
（6）水洗
（7）脱水,透明,封固
3、结果：淀粉样物呈桔红色。
4、类淀粉染色的应用：
确定淀粉样变性及玻璃样变性的胶原组织，后者在刚果红法染色后呈淡桔色，常用于诊断甲状腺髓样癌和胰岛细胞瘤等。
L
六胺银染色法1、试剂配制：
六胺银液配制：
3%六次甲基四胺水溶液 5 ml
2.5%硝酸银水溶液 0.5 ml
摇晃，变清，再加2.5%四硼酸钠1.5~2 ml加蒸馏水至30~40 ml
2、步骤：
（1）切片脱蜡至水，蒸馏水洗
（2）0.5%高碘酸浸15分钟，蒸馏水洗
（3）六胺银液60℃，1-2小时，（或六胺银液80-90℃，半小时左右）蒸馏水洗（镜下基底膜呈黑色）
（4）0.2% 氯化金调色数秒
（5）丽春红淡染
（6）水速洗
（7）烘干，透明，封片。
3、结果：肾小球基底膜呈黑色，霉菌，弹力纤维及一些网状纤维也呈黑色。
M
Mallory 三色法1、步骤
（1）切片脱蜡至水
（2）0.5%酸性复红水溶液1 min
（3）蒸馏水洗
（4）入下液1-2min
苯胺蓝0.5g，桔黄G 2g，磷目酸或磷钨酸 1g，蒸馏水100ml。
（5）蒸馏水洗
（6）95%乙醇分色
（7）脱水，透明，封片。
2、结果：胶原纤维蓝色， 红细胞桔黄色，核红色。
Mallory磷钨酸～苏木素染色法（PTAH）
1、试剂配制：
苏木素 0.1 g 磷钨酸 2.0 g 蒸馏水 100 ml
先将苏木素加热溶于20毫升蒸馏水,再将磷钨酸溶于80毫升蒸馏水。等苏木素冷却后，加入磷钨酸溶液，混合，放置数星期后，才可使用。如急用，可加入0.2 g高锰酸钾,加速其成熟。
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水。
（2）放入0.25%高锰酸钾水溶液5分钟。
（3）蒸馏水洗。
（4）2.5%草酸漂白5分钟。
（5）蒸馏水洗多次。
（6）置于磷钨酸苏木素溶液12～24小时。
（7）95%酒精快速分化，滤纸吸去剩余酒精，置60℃温箱中烘干。
（8）二甲苯透明，封固。
3、结果：纤维胶质，肌胶质，神经胶纤维，纤维素，横纹肌等均染成蓝色。胶原，网状纤维和骨基质着黄色或砖红色。在工作中常用于观察横纹以证实肿瘤细胞是否有横纹肌分化特征。
Masson 三色染色法、
1、试剂配制：
丽春红酸性品红液： 丽春红 0.7 g 酸性品红 0.3 g
蒸馏水 99ml 冰醋酸 1 ml
苯胺蓝液: 苯胺蓝 2 g 蒸馏水 98 ml 醋酸 2 ml
亮绿液： 亮绿 0.2g 蒸馏水 100 ml 冰醋酸 0.2 ml
苦味酸酒精液:苦味酸在95%酒精中的饱和液 20 ml,加95%酒精10 ml
2、染色步骤：
（1）切片脱蜡至蒸馏水
（2）苏木素染5～10分钟
（3）盐酸酒精分化
（4）流水蓝化，蒸馏水洗(苏木素可不染)
（5）丽春红酸性品红液中染5～8分钟
（6）蒸馏水洗
（7）1% 磷钼酸中染1～3分钟
（8）不用水洗直接入苯胺蓝液或亮绿液5分钟 (如染色效果不佳,可在冰醋酸内脱色后重染)
（9）水速洗，置60℃温箱中烘干，二甲苯透明,封固
3、结果:胶原纤维蓝色（苯胺蓝复染）或绿色（亮绿复染）,肌纤维、纤维素红色。
4、注意：
（1） 此法广泛用于胶原纤维和平滑肌的鉴别，也为肾组织活检，观察肾小球病变的重要染色法，常用于观察缺血病变的心肌。 用于观察肾小球病变时，一定要用2um以下半薄切片。
（2） 细胞核染色后分化很重要，观察控制着色程度。而HE染色则是最常用的一种常规染色方法，但无法区别胶原纤维和肌肉。
N
粘液染色
（一）PAS染色法
与染糖元的方法相同。
（二）AB(pH2.5)染色法
1、试剂配制：
爱先蓝8GX 1 g 蒸馏水 97 ml 冰醋酸 3 ml
核固红液: 核固红 0.1g 硫酸铝 5g 麝香草酚 50mg 蒸馏水 97ml
2、染色步骤:
（1）切片脱蜡至蒸馏水。
（2）爱先蓝液染10～20分钟
（3）蒸馏水洗
（4）核复染(核固红5分钟)，水洗
（5）脱水,透明,封固。
唾液酸及弱硫酸化粘液及一般粘液呈蓝色。常用于确定胞浆内空泡的性质，特别是当细胞呈现印戒样特征时。
J
甲基绿派洛宁法（改良Cook，1974）
1、试剂配制：
（1）2%甲基绿水溶液：
甲基绿（methyl green）1g
蒸馏水加至50ml
用三氯甲烷抽提，方法详后。
（2）5%派洛宁水溶液：
派洛宁G（pyronine G）1g
蒸馏水加至20ml
（3）0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8）
0.2M醋酸液41ml
0.2M醋酸钠液59ml
（4）甲基绿派洛宁染液：
2%甲基绿水溶液（经抽提） 5ml
5%派洛宁水溶液 1ml
蒸馏水 12ml
0.2M醋酸盐缓冲液（pH 4.8） 18ml
甲基绿水溶液的抽提：甲基绿为绿色粉末，属三苯甲烷染料，这种染料是由氯代甲烷作用于结果晶紫而形成的一种化合物。由于甲基化作用，甲基绿就比甲基绿后，所引进的甲基连接得并不牢固，容易从甲基绿中脱失。另一方面，在甲基化过程中，还有一部分结晶紫并没有生成甲基绿，因此，也有人认为甲中，常有少量的甲基紫或结晶紫成份。但是，也有人认为甲基紫乃是甲基绿的衰败产物，甲基绿在储存过程中，会不断产生甲基紫。因此，在配制试剂时，必须先将甲基绿所含的甲基紫或结晶紫抽提出来，才能使细胞核内的脱氧核糖核酸染成绿色。抽提方法是取2%甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗，加入三氯甲烷20ml充分摇荡混合，使其内的甲基紫溶于三氯甲烷中而呈紫红色。旋动分液漏斗下部的砂塞，慢慢把如此反复更换三氯甲烷，直到三氯甲烷无紫红色为止，即可得到得纯的甲基绿溶液。
2、操作步骤：
（1）新鲜组织固定于Carnoy氏液（4℃）3~6小时，经95%酒精和无水酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
（2）切片经二甲苯脱蜡至蒸馏水。
（3）置入甲基绿派洛宁染液于室温染30~60分钟。
（4）取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。
（5）用丙酮迅速分化。
（6）转入丙酮二甲苯（1:1）稍洗。
（7）二甲苯透明2~3次。
（8）中性树胶封固。结果：存在于胞质和核仁内的核糖核酸呈红紫色，胞核染色质内的脱氧核糖核酸绿色或绿蓝色。
3、对照方法：
（1）取另一连续切片用核糖核酸酶（rihonuclease）1mg/1ml于37℃温箱内消化3小时，蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。
（2）切片在10%高氯酸（prechloric acid）于4℃处理12~18小时，水洗后用1%碳酸钠液中和2分钟，流水冲洗5分钟，再用蒸馏水洗后置入甲基绿派洛宁染液内染色。经上述方法之一处理后的切片就为阴性。
4、注意事项：
（1）组织不宜用甲醛固定，应选用Garnoy氏固定液，因为酒精和醋酸能较好地保存核蛋白。
（2）Garnoy氏液固定标本的时间不宜太长，超过一天则染色效果不理想。
（3）要注意试剂的质量，特别是派洛宁，常常不同批号的染料，染色的效果不同。甲基绿和派洛宁二者的比例要恰当。
（4）染色液的pH应为4.8左右，如pH过低，甲基绿染色效果差；pH偏高，则派洛宁染色效果不良。
（5）丙酮分化时间要很好掌握，时间不宜太长。
（6）配妥的甲基绿派洛宁染液用后放冰箱保存，约可使用数周。
染色原理：对此法的染色原理，目前了解得还不够清楚，一般可从下面两方面理解。1、电离作用：脱氧核糖核酸和核糖核酸都有磷酸基，又有碱基，故为两性电解质。在一定的条件下，可以电离而带电荷，因此都有一定的等电点。甲基绿和派洛宁在水中电离后，都产生带阳电荷的离子。甲基绿电离后，在五价氮处产生二个正电荷，碱性较强。派洛宁电离后仅产生一个正电荷，碱性较甲基绿弱，在染色时二者进行竞争，碱性较强的甲基绿就与胞核（等电点pH3.8~4.2）进行极性吸着而结合，碱性较弱的派洛宁与胞质（等电点pH4.6~5.2）吸附结合。2、聚合作用：甲基绿对聚合高的DNA有亲和力，派洛宁对聚合低的RNA有亲和力。因此，思虑在绿选染DNA，而派洛宁选染RNA。应用：PNA主要存在于胞质及核仁内，它主导细胞的蛋白质合成。在细胞增生，胞质蛋白质合成亢进时，核仁和胞质的PNA增加。因此，恶性瘤细胞核仁巨大，胞质嗜碱。浆细胞和免疫母细胞胞质合成免疫球蛋白，胰腺上皮合成胰蛋白酶。因此，这些细胞胞质有很强的嗜碱性。胞质嗜碱，是蛋白质合成增强的标志。
S
脂肪（苏旦Ⅲ）法
1、试剂配制：
苏旦Ⅲ 0.1～0.2 70% 酒精 100 ml
将苏旦Ⅲ置于70%酒精中,加热饱和,在未冷前过滤,静置一夜。
2、染色步骤：
（1）冰冻切片（8～10微米）。
（2）70%酒精固定1分钟。
（3）放入苏旦Ⅲ酒精溶液中20～30分钟。
（4）70%酒精洗去多余的染料。
（5）水洗。
（6）苏木素复染2～5分钟。
（7）1%盐酸酒精分化。
（8）水洗，蓝化,甘油封固。
3、结果：脂肪桔黄或红色。一般用于确定胞浆内空泡究竟是糖原，水变性还是脂滴。
P
高碘酸-六胺银-马休黄染色法(PASM-M)
1、试剂配制：
六胺银原液： 3 %六甲基四胺水溶液(乌洛托品) 20 毫升，5 %硝酸银水溶液 10 毫升。
六胺银工作液：六胺银原液30毫升，双蒸水 20毫升，5 %硼砂(四硼酸钠)2毫升。
核固红液：核固红0.1 克，5 %硫酸铝100毫升加热溶解，贮存饱和液待用。
马休黄液：马体黄 0.5 克，无水酒精 98 毫升，磷酸 0.2 克。
2、操作方法：
（1）常规脱蜡至水
（2）0.5%氧化20分钟
（3）蒸馏水洗3次
（4）浸入六胺银工作液中2小时左右(恒温58℃)
（5）蒸馏水洗3次
（6）0.2%氯化金1-2分钟
（7）蒸馏水洗2次
（8）核固红染色10-15分钟
（9）马休黄染色1分钟
（10）放入温箱烤干，二甲苯透明，中性树胶封固
3、结果：肾小球毛细血管基膜呈黑色，背景和红细胞呈黄色，细胞
核呈红色。
4、注意： 1、六胺银工作液现配现用，只能用一次。
2、第3步做完后可入5 %三氧化铬(铬酸)水溶液氧化40 分
钟，再用1 %亚硫酸钠除铬，背景可能效果更佳。
3、马休黄主要是染红细胞。用无水酒精中脱水，黄色的背景就脱掉，可直接放入
温箱或电吹风吹干，封片。
R
瑞氏－姬姆萨染色方法
1、试剂配制：
原料:A:瑞氏染粉0.8--1克；吉姆萨染粉0.5克
B:甘油33ml
C：甲醇500ml
配法：将A放入研钵中，加入少量B研磨，再加入少量B磨，再加入少量B磨……倒出，将未溶部分，继续加入B磨……>全溶，加入C，或中间加入C 亦可。
2、染色步骤：
滴数滴入玻片盖满标本，30秒，再加入双蒸水或PBS2-3倍染1-3分中，倾去染液，水洗……封片。
T
Trypan blue （台盘兰）排斥实验：
细胞悬液0.1ml加入0.4% Trypan blue生理盐水溶液0.1ml,混匀后滴在血球记数板上。存活率=不着色细胞数/细胞总数X100%
TTC方法：
TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲月赞，用来表示细胞的活力。配制多为2％，染色要避光，37度条件下，它是评价脑缺血损伤常用的指标。
V
Van Gieson法 1、试剂配制：
饱和苦味酸水溶液（约1.22%） 150 ml
1%酸性品红 10 ml
两种溶液用前混合在一起。
2、染色步骤：
（1）切片脱蜡至蒸馏水。
（2）苏木素深染。（10～15分钟）
（3）Van Gieson中染半分钟。
（4）蒸馏水洗。
（5）置60℃温箱中烘干。
（6）二甲苯透明，封固。
3、结果：胶原纤维红色，肌纤维、胞浆、红细胞黄色。
4、建议：用稀释的Van Gieson液进行染色，不用95%的酒精分化，结果色泽鲜艳，而且着色均匀。