先上后下字谜:转基因水稻检测方法的研究进展

李伟丰1,2，杨朗3*
（1广西出入境检验检疫局  南宁  530028；2 华南农业大学资源与环境学院  广州 510642；
 3 广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室 南宁 530007）

 摘 要： 近年来，转基因作物在全球得到了迅猛发展，1988年第一批水稻转基因植株问世以来，各国科学家在水稻转基因研究领域取得了一系列成果，而对转基因水稻及其产品的检测，也成为世界各国公众关心的热点，本文从PCR法、基因芯片法等讨论转基因水稻的检测方法的研究进展，让读者对转基因水稻检测方法有初步的认识和了解，对开展转基因水稻检测的研究工作有一定的参考价值。
 关键词： 转基因  水稻  检测方法  PCR，基因芯片

Current Development of Detecting Methods in Transgenic Rice
Li Weifeng1,2  Yang Lang3
(1．Guangxi Entry?鄄Exit Inspection & Quarantine Bureau, Nanning,Guangxi 530028;   2.Lab.of Insect ecology, South China agricultural University, Guangzhou, Guangdong 510642;  3 Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab, Guangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanning, 530007)
　　
 Abstract: Transgenic plants have been developed in recent years. Scientists of all over the world have gained great achievements since the appearing of the first transgenic rice in 1988. At the same time, the food safety assessment and detecting of transgenic rice has been a world wide concerned issue. In this paper, detecting methods about transgenic rice were discussed, such as PCR, gene chip method and so on. The described method provides a useful tool for researching program of transgenic rice detecting.
 Key words:  Transgene  Rice  Detecting method  PCR  Gene chip

 转基因作物Transgenic crop又称基因改造作物或基因改良作物Genetically Modified Organisms（GMO），通过对基因的改良，达到提高产量、增加营养、抗病、抗旱、防虫等目的，人为地给某一种作物植入另一种生物的遗传基因。转基因技术是指用人工方法将外源基因或DNA 导入受体生物细胞中,使之稳定地整合、表达并遗传的综合技术。自1984 年世界上第一例转基因植物延迟成熟蕃茄的问世,至1995 年抗虫转基因马铃薯进入商品化生产,次年,抗虫转基因棉花和玉米也进入商品化生产,转基因农作物由此得到了迅猛发展。全球转基因作物的种植面积从1996年的170万hm2,猛增至2002年的5870万hm2。目前种植面积最大的国家是美国,占66%,接着依次是阿根廷、加拿大、中国等;种植作物最多的是大豆和玉米,分别占62%和21% ,其次是棉花、油菜等;就转基因的性状而言,抗除
 草剂作物种植面积最大,占75%,其次是抗虫作物,占17%。美国自1995年批准转基因Bt玉米的商品化生产后,至今已有玉米、油菜、棉花、烟草、马铃薯、蕃茄、甜瓜、南瓜等8种作物共计34个品种实现了商品化生产。自第一批水稻转基因植株在1988年问世以来，许多国家在水稻转基因研究领域取得了一系列成果，很多转基因水稻品种已进入田间实验，被获准大面积环境释放，并不断向实用化发展。随着世界各国公众对转基因食品安全性的关心，转基因生物及其产品的检测任务越来越重，工作难度越来越大，速度要求也越来越快，检测方法也不断改进与改善。近年来，通过转基因技术生产的食品以其独特的品质和特性深受人们的关注，它既被称为“新世纪的食粮”，但其安全性也令人关注与担忧。因此，对转基因作物进行检测和标识已势在必行[1]。下面就转基因水稻的检测方法作简单的总结。
1 转基因水稻简介
 在转基因水稻方面，研究较多的是转Bt基因水稻[2,3]。转Bt基因技术主要采用农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等方法。目前，国内Bt 基因导入棉花中的研究及商品化生产已有长足发展，但在水稻方面尚停留在环境释放阶段。转Bt水稻做得较成功的是浙江大学核农所，该所舒庆尧等与加拿大渥太华大学合作，利用农杆菌介导法，获得了抗虫转基因植株，于1998年通过浙江省技鉴委的技术鉴定，并定名为克螟稻，它是国内第一个育成的自交繁殖代数最高，抗性遗传最稳定(100 %抗性)、Bt毒蛋白含量表达最高(1%)、最具生产与育种应用价值的转基因水稻抗虫品系[4,5,6]，并被农业部生物基因工程安全管理委员会确定其生物安全等级为1级，即最安全等级。Bt基因对二化螟、三化螟、大螟、稻纵卷叶螟、稻青虫等8种水稻鳞翅目害虫具有较高的抗性，近几年宁波市农科院、杭州市农科所先后与浙大核农所合作，利用Bt 基因转育出一批抗虫性稳定、基因型纯合的常规稻或杂交稻恢复系。台州市农科院与核农所于2001年开始合作，目前已初步筛选出基因型为纯合的部分抗虫株系。其它转基因水稻研究包括转cry1Ab基因水稻[7]，转?鄄glucuronidase(gus)基因水稻[8], 转雪花莲凝集素(GNA)基因水稻[9,10]，抗草铵膦转基因粳稻[11]，转SCK基因水稻[12],转甜菜碱醛脱氢酶(BADH)水稻[13]，转水稻碱性几丁质酶（RC24）基因、芷蓿葡聚糖酶（β?鄄Glu）基因、大麦核糖体失活蛋白（B?鄄RIP）基因和潮霉素基因水稻[14]，这些转基因水稻的研究都取得了很大的进展。
2 转基因成分的检测
 转基因植物是为了使植物获得抗病、抗虫、抗除草剂、提高作物品质、产量等性状。所以在进行植物的转基因改造时，植物中必须导入能够表达上述性状的目的基因，同时要在植物中表达这些外源目的基因，还需一个完整的表达调控系统，其中主要包括启动子、终止子以及在构建和鉴定表达系统时所需的选择标记基因。对转基因植物的检测主要通过检测调控序列启动子、终止子、选择
 标记基因进行初选，然后再对具体的目的基因检测。
 总的来分，对转基因植物的检测可分为定性检测法和定量检测法。目前常用的转基因作物检测方法有PCR 检测法、化学组织检测法、酶联免疫吸附法、外源基因整合鉴定法、Western杂交法、生物测定检测法和基因芯片法等[15,16]。
2.1 PCR法
 PCR法被认为适合用于各类样品包括原料和经过加工的食品[17,18]。PCR 法定性检测包括常规PCR及改进的PCR，常规PCR有简单的PCR，也包括多重PCR（Multiplex Polymerase Chain Reaction, MPCR）。简单的PCR通常只针对某种转基因(通常是目的基因)或其产物，只能满足一种或少数几个转基因品种的检测需要，检测方法繁琐，工作程序重复且耗费大量时间，已不能满足当前工作中快速通关的要求。多重PCR(MPCR)也称复合PCR，是一种特殊的PCR技术，比单一PCR反应更快捷，更经济，只需1次PCR反应，就能同时检测多个片段（靶标基因）,节省模板DNA、节约时间和减少费用[19]。目前这项技术在动物病毒性传染病和人类病检测中应用较多[20,21]在植物转基因研究方面也有较多的研究[22?鄄25]。
 常规PCR结合电泳检测法，强调需应用酶切、杂交或测序等方法对PCR产物做进一步确证，方法较烦锁。改进的PCR，如地高辛标记的PCR?鄄ELISA技术（Dig?鄄PCR?鄄ELISA）近年来被应用于动植物病毒检测研究[26]。Dig?鄄PCR?鄄ELISA技术包括PCR及对PCR产物的杂交检测，并通过引入酶促显色系统结合了ELISA技术的特点，特异性和敏感性均比常规PCR结合电泳检测有明显提高；检测结果可数值化表达。能实现半定量检测，且该技术不需分离纯化PCR产物，操作简化，所需的全套试剂及生物素包被的酶标板均已商品化，检测技术更易实现标准化，已用于检测转基因水稻[27]。高秀丽等（2002）研究通过在引物延伸中加入地高辛标记dUTP，然后通过EL ISA显色来实现检测，直接通过普通的扫描仪对结果进行扫描、分析，采用不对称PCR法对样品DNA进行扩增，与常规的PCR 扩增相比，杂交效果明显提高，为微测序反应优化了条件[28]。
2.2 外源基因整合的鉴定
 主要是通过核酸分子杂交，包括Southern (DNA印迹法)杂交法和Northern(RNA印迹法)杂交法[29,30]。这些方法需要转膜、杂交，操作繁琐、费用高、检测时间长，不大适合大批量样品的检测，现在应用不多。
2.3 定量检测法
 最近欧盟修改了其食品管理策略，GMO(遗传修饰生物体)含量大于5%的食品必须进行标签, 于是由定性PCR转向定量PCR,包括实时定量PCR检测和荧光PCR检测方法。实时定量PCR方法检测转基因产品，操作简单，省时省力，结果可靠、准确性高，只是荧光定量PCR仪价格昂贵，暂时难以普遍推广应用[31]。荧光PCR检测方法，操作简便快速，并具有本底低及稳定性好的特点，它在保证灵敏度的同时，实现了对转基因成分的特异性检测，经济实惠，特别适合于大批量检测[32~34]。数量竞争性PCR(QC?鄄PCR，quantitative competitive PCR) 的方法定量性也较好，已在转基因食品检测中应用[35]。
2.4 基因芯片
 常规的一些转基因植物的检测方法已经不能满足目前快速、准确检测的需要，这些方法有的需要转膜、杂交，操作繁琐、费用高，有的不适合大批量样品的检测。
 从1992年Affymetrix公司首次合成第一块基因芯片诞生以来，在之后的十几年里该技术以其高通量、平行性、多样化、微型化、自动化的显著特点被广泛应用到了各个领域，展现出了巨大的发展前景。基因芯片（gene chip）亦称DNA芯片、DNA微阵列，是最近几年才发展起来的一种多学科交叉融合产生的高新技术产品。它是专门用来检测核酸的生物芯片，也是目前应用最广泛的微阵列芯片[36]。基因芯片指的是在固相载体（如硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等）上按照特定的排列方式，固定上大量已知序列的DNA/RNA片断，形成DNA/RNA微矩阵，将样品基因组,DNA/RNA进行体外扩增并掺入标记分子后，与位于微阵列上的已知DNA序列杂交，通过激光共聚荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，并用计算机软件进行数据的比较和综合分析后，获得样品中大量的基因序列特征或基因表达信息[36]。
 对于目前还没有通用检测方法的转基因产品检测，基因芯片技术可以快捷准确地对其检测。将目前通用的报告基因、抗性基因、启动子和终止子的特异片断制成检测芯片与待测产品的DNA进行杂交，杂交信号由扫描仪扫描后再经计算机软件进行分析，就可以判断待测样品是否为转基因产品，其可靠性已被对大豆、玉米、油菜、棉花等农作物样品的检测结果所证实。另外，利用该技术也可以筛选转基因所需要的目的基因。该检测技术具有如下特点：(1)选择检测的报告基因是具有明显区别于受体细胞遗传背景的选择标记，通常是在离体条件下易于检测的酶或发光蛋白；(2)该技术综合了PCR 和分子杂交的优点，用量少，快速而且准确;(3)芯片具有高密度、高通量的优点，可同时检测报告基因、抗性基因、启动子和终止子，非常适合于转基因作物及加工品的检测，使之具有广阔的发展前景；(4) 检测结果直接由分析软件进行处理，使得检测结果更加科学、准确[37]。
 基于杂交基础的芯片检测方法，一方面检测的特异性不是很高，另一方面探针的设计具有一定难度且要求探针的长度很短(15~20bp)；而基于微测序技术的生物芯片不仅通过分析样品和探针间的热稳定性的差异来区分样品，还利用DNA 聚合酶催化的引物延伸来检测目的基因，其特异性表现在两个方面:(1)DNA聚合酶掺入与模板互补碱基的高度特异性(如测序)；(2)DNA聚合酶引发延伸反应时要求PCR引物3′端与靶DNA序列完全互补的严格性(如等位基因特异性PCR)[38]。
　　高秀丽等[39]探讨了用基因芯片这一新的检测手段对转基因植物的初步检测，采用一种新的反应机制—引物延伸芯片法(arrayed primer extension) [40?鄄41]，实现样品扩
增和杂交、标记和检测的一步化,既省去了以往基因芯片检测前样品的扩增、标记又解决了大片段待测基因样品和探针的杂交问题，从而为目前基因芯片中大片段样品的检测提供了一种可能性，是基因芯片杂交技术中的一种突破，其所利用的芯片引物延伸法是在微测序法(minisequencing)[42]基础上发展起来的，它通过在微阵列上的引物的特异性延伸来确定基因型。
 基因芯片技术从产生到现在才不过短短十几年的时间，尽管它还有许多不完善的地方，但它在生命科学的各个领域的应用已经展示出了其蓬勃的生命力，由于现代生物学研究已深入到了基因水平，而许多疾病和遗传信息的改变都与基因有关系[43,44]，因此，以基因芯片为手段的研究将会有着非常巨大的商业价值和良好的发展前景，基因芯片技术必将会为今后的生命科学领域带来一场新的革命。
由于转基因技术对人类医学和应用领域尤其是农作物的发展有着巨大影响，各国也都将其作为重点发展的领域。然而，具体到转基因产品，世界各国谨慎对待，反应不一。中国政府也把转基因技术作为重点研究领域，对转基因食品则持谨慎态度，同时先后出台了一系列基因工程的安全管理办法，对转基因技术的应用加强了管理。作为我国主产粮食水稻转基因产品的商品化生产，在不久的将来也许会得到国家准许。而转基因食品检测技术的发展趋势应是操作简便、费用较低、适用性强，对现有或新出现的转基因食品都能快速方便准确地检测。