三命熊猫是在多少分钟?:医院感染（连载六

第六章  医院感染的流行病学与病原学
流行病学是研究人类疾病流行与决定健康的因素，借此找出疾病的起因，疾病传播的途径，人类易感因素以及环境状态，即是人体、病原与环境平衡相关因素。
第一节  医院内感染病原微生物的来源
一、外界环境病原微生物
1．医院环境、医院建筑面积及各诊疗单位结构分布是否有利于感染管制，应注意并慎防医院病房、走廊的地面、门窗、废弃污物、供水及膳食等病原微生物的状况。病人所需的生活各种用具与物品、医疗设备器械以及日常诊疗所用的静脉输液器、各种体腔引流管等是否有潜在病原存在。
2．院内其他住院病人或医护工勤人员患有活动性疾病，或正处于疾病的潜伏期，或他们就是带菌者。
二、内源性病原微生物
在正常状况人体口咽部、呼吸道、肠道、生殖泌尿道等部位都有细菌寄生繁殖，这些细菌多数是非致病菌，其中部分是条件致病菌，少数是致病菌，它们相互制约与宿主维持平衡状态不引起发病。流行病学调查表明，院内感染病原微生物多是革兰氏阴性杆菌，尤其是肠杆菌属所引起，其感染源多是来自体内正常寄居菌群，肠道是人体内寄居菌最大的细菌库，是内源性感染主要的隐性感染源。正常的机体状态，肠道能够保护宿主免受肠内细菌及其毒素入侵，当肠屏障功能遭受到损害或某种因素如长期大量使用广谱抗菌素、较长时期的胃肠外营养等引起肠内菌群失调，就可导致肠腔内细菌或毒素穿出肠壁进入淋巴、血流或非正常定居的组织、脏器，引起肠源性感染。这种自身性感染已成为当代院内感染所关注的课题。
第二节  院内感染传播方式
一、接触感染
接触感染是传统院内感染常见的传染方式，可分为如下几种情况：
1．直接接触：通过相互之间直接接触传播病原微生物。如医护人员的手将各种病原微生物由甲病人带到乙病人，引起乙病人发病，经手部带的病菌有葡萄球菌、链球菌及一些革兰氏阴性菌如肠杆菌属等。
2．间接接触：由污染的诊疗器械设备、敷料以及日常生活用品如餐具、衣物等将致病原传染给易感宿主。目前常见的有静脉插管、各种穿刺引流、内镜、导尿、呼吸器等侵入性诊疗方法所造成的院内感染。
3．口沫传染：含病原微生物的飞沫，经由咳嗽、谈话在30  厘米之内传入易感宿主鼻咽口而引起的感染，如脑膜炎、肺炎、百日咳、腮腺炎、流感等。
二、空气传播
病原微生物附着在空气中飞扬较高的飞沫颗粒、尘埃中，这些微细的颗粒可以漂浮1米以外，并在空气中漂浮较久，吸入此种空气就可以引起感染，如结核、风疹、麻疹、猩红热等。
三、媒介传染
被病原微生物污染的食物、水、静脉输注的液体、血液以及某些血清药品传给人体，如病毒性肝炎，军团菌病及沙门氏菌属、肠杆菌属、真菌等引起的院内感染疾病。
四、病媒感染
媒介昆虫叮咬引起的传染性疾病，如受虱或蜱叮咬传播的病原螺旋体引起的回归热，传播普氏立次体引起的流行性斑疹伤寒，由蚊叮咬传播疟原虫引起的疟疾，传播虫媒病毒引
起的黄热病等。
五、细菌易位(Bacteriatranslocation)
是指人体内正常定居部位的常驻菌群中某一菌种迁移到非正常定居的无菌组织或器官，引起感染性病变，导致细菌易位的因素有菌群失调(Dysbaeteriosis)、栖居于人体的菌丛中  细菌的种类、数量和定植抗力(Colonizationresistance)发生紊乱。轻度菌群失调经过人体自身调节和免疫防御能力的增强，菌种间失衡状态很快消失，机体并不会受到很大的影响和损害。如果出现严重菌群失调，优势菌大量繁殖，这些多是耐药菌株或是条件致病菌出现易位对机体可造成一系列的病理、生理改变。促发细菌易位另一些因素是身体的解剖与生理防   御屏障受到损害。
第三节  医院内获得性感染的部位与菌种
一，医院内感染的频率与部位
影响医院内感染发生的频率与部位的因素是诸方面的，与医院的性质、住院病人的年龄、住院时基础病的严重程度、介入性治疗与监测装置、抗菌药物、免疫抑制药使用的范围，以及是否有并存性疾病，还与医院建筑结构、地面、空间开阔程度、医院各诊疗单元的分布、工作流程以及医院工作人员的素质等有关。上海华山医院1985—1987年院内感染年发病率是  13．1％，感染部位发病情况是肺部占45．2％、尿路为18％、伤口10％、肝胆道7．5％、败血症为5％、皮肤、腹腔、胃肠道等感染发生率均低于5％。院内感染危险度单因素分析证实年龄在65岁以上、胆管引流、留置导尿、气管切开及气管插管、结缔组织病、危重疾病、应用免疫抑制剂、慢性疾病、损伤性操作、伤口引流、污染手术、多种抗菌素使用等十二项具有重要性。1993年美国医院获得性感染统计资料，年院内感染率是3．35％，感染发生部位依次是泌尿道感染38％、下呼吸道感染18％、外科伤口感染17％、皮肤组织感染和因静脉导管或血管内插管所致的菌血症各占6％和8％、其他部位总数是 13％。台湾长庚医院资料1988—1990年，院内感染年发生率是2．4％，泌尿道感染占首位是41％、血流感染18％，伤口感染12。3％、下呼吸道感染占11。8％。台湾荣民医院年院内感染率是3．71％，泌尿系感染占院内感染病例31．9％、外科伤口感染占17．?％、血流感染15．8％、呼吸道感染14，6％。泰国曼谷1991年资料，院内感染年总发病率是11．7％，以5-15岁占比例最大，各科室发生情况是在加强监护病房 (ICU)，院内感染率是35％，骨科发病20.4％、普通儿科 15．7％、新生儿监护区36．5％、外科发病14。6％。兰医二院普通外科1994年院内感染统计资料，院内感染总例数是139例，年发病率是14．6％，呼吸道感染占院内感染总数的 59．72％、外科伤口感染占17．26％，因静脉输液，静脉插管所致的软组织及静脉炎、腹腔胃肠道感染、胆管引流感染、泌尿道感染等发生率均低于3％，持续较长时间的输液反串者占 9．35％。
二、院内感染最常见的微生物
引起院内感染的常见病原是肠源性肠杆菌、肠球菌、耐药菌株以及条件致病菌、霉菌和病毒。近30年由于临床医学、临床药物学越来越精湛发展，危重病例被抢救成功率日增，这些患者经常需要应用各种高效广谱抗菌素以防治危及生命的各种感染，因此在这些监护治疗单元内耐药菌株和新的病原菌也不断出现。上海华山医院1985—1987年总计分离出院内感染菌株271株，革兰氏阴性杆菌180株，占总数66．4％，革兰氏阳性球菌62株，占22．9％，还有念珠菌与曲霉菌。美国疾病控制中心1982年资料，院内感染最常见的病原是大肠杆菌为 17．8％、绿脓杆菌11．4％、肠球菌10．4％，金黄色葡萄球菌 10．3％，1993年美国德克萨斯州休斯顿市圣路加医院资料，院内感染的病原是大肠杆菌为18．5％、克雷伯氏杆菌／肠杆菌为13。9％、粪链球菌13。3％、绿脓杆菌列在第四位，金黄色葡萄球菌，念珠菌有逐升趋势，而脆弱类杆菌则稍有下降。台湾长庚医院院内感染病原资料是大肠杆菌占14．9％、绿脓杆菌12．2％、克雷伯肺炎杆菌9。4％、金黄色葡萄球菌8．6％、肠球菌6．2％。泰国曼谷医院内感染病原学资料是，绿脓杆菌占22.0％、大肠杆菌18．1％、克雷伯杆菌14。0％。兰医二院普外科院内感染最常见的病菌是肠杆菌属。由此可见革兰氏阴性菌是院内感染的主要菌种。
1．泌尿道感染最常见的致病菌。
美国疾病控制中心报告为大肠杆菌占30.0、肠球菌 14.7％、绿脓杆菌12.7％。台湾长庚医院报告资料是大肠杆菌占23.6％、绿脓杆菌占11.4％、克雷伯肺炎杆菌占 10.7％。
2．外科伤口感染致病菌。
CDC资料是金黄色葡萄球菌18.6％、肠球菌12.1％、大肠杆菌11.5％。台湾长庚医院资料是金黄色葡萄球菌为 26.7％、肠球菌11.4％、大肠杆菌21.5％、假单胞菌10.6％、克雷伯杆菌13．6％。
3．下呼吸道感染致病菌。
1985—1988年国内一组院内获得性肺炎病原体分析，革兰氏阴性菌58.7％，革兰氏阳性菌17.6％，白色念珠菌 3.7％。在革兰氏阴性菌中，绿脓杆菌占17.2％、肠杆菌 10.4％、肺炎克雷伯杆菌7．4％、大肠杆菌6．4％、沙雷氏菌 4．5％、奇异变形杆菌3.4％。革兰氏阳性菌中金黄色葡萄球菌14．6％、肺炎链球菌3．0％。CDC统计院内下呼吸道感染病原体资料绿脓杆菌占下呼吸道感染致病菌中16．9％、金黄色葡萄球菌占12．9％、克雷伯杆菌占11．6％。台湾荣民医院资料是以假单胞菌居首、克雷伯菌居次、金黄色葡萄球菌第三位、大肠杆菌居第四位。菲律宾资料是绿脓杆菌占54％、克雷伯杆菌是14％、不动杆菌为10％、肠杆菌属为9％。医院内获得性肺炎的病原不断演变，过去20年，革兰氏阴性杆菌是最常见的病原。随着第三代头孢抗菌素的应用，有些革兰氏阳性球菌感染又呈上升。华南地区一份资料，在302个痰标本中培养28种致病菌、277个菌株，厌氧杆菌占27．5％、肺炎双球菌 9．4％、流感嗜血杆菌9．4％、溶血性链球菌8．4％、克雷伯杆菌8．4％、绿脓杆菌8．9％。病人住院经常规抗菌素治疗后逐渐出现绿脓杆菌，在儿科病房呼吸道合胞病毒亦是小儿院内感染重要病原，呼吸道合胞病毒经患儿鼻分泌物排出，很容易在医院内传播，使医护人员及住院儿童获得感染。
4．血流感染致病菌。
CDC报告资料是凝固酶阴性葡萄球菌(coagulacenegative  staphylocacei—SCN)感染占14．9％、金黄色葡萄球菌占12．3％、大肠杆菌占10．1％。荣民医院的资料依次为大肠杆菌、克雷伯杆菌、绿脓杆菌。革兰氏阴性杆菌菌血症在老年组明显增多，其常见的侵入途径是泌尿生殖道、胃肠道、胆道和腹腔，患者基础疾病多是恶性肿瘤、多种手术、糖尿
28病等。最近20年，嗜中性白细胞减少的病人，菌血症的病原体种类发生了变化，1973年以革兰氏阴性菌为主占71％，到 1991年降至31％。以前认为是非致病性的革兰氏阳性菌所致的菌血症发生率逐年增加，念珠菌引起的血流性感染成为新兴的病原体。
第四节  医院内获得性感染的因素
影响医院内感染的危险因素：病人基础疾病的严重程度、免疫机能状态、介入性诊疗装置使用的范围、抗菌素使用的状况以及住院期限、医院工作人员的素质。院内感染发生率较高的区域，常见于患者免疫功能低下或防御机能受损的医疗单元。近20年由于临床医学、临床药物学、临床介入诊疗与监测技术的发展，使其一些致命性疾病患者获得较长时期的生存，这部分患者也必然需要较长时期的住院与监护，接受较为复杂的诊疗技术。此外，肿瘤的化学治疗或由于某种预防与治疗的需要，较大剂量与较长时间的使用免疫抑制剂、激素类药物，以及粒细胞减少患者等诸因素均会影响院内感染的发生。
一、生理机能减退，防御屏障受损
住院病人由于基础疾病造成机体的生理解剖机能明显减退，自身免疫防御体系受到严重干扰与损害。如癌症患者免疫·功能就受到抑制再接受全身性放疗、化疗必然普遍发生嗜中性自细胞减少，当粒细胞数下降至2000—1000／mm3时，感染率则会显著增加。在结缔组织病、肾脏病、器官脏器移植等患者，接受激素、免疫抑制剂治疗期，病人的免疫功能必然遭受到损害。有些患者因某种原因胃肠消化液、第三间隙体液大量丢失或不能经胃肠道进食，胃肠外营养支持不全，肝糖原、肌蛋白大量分解形成自身大量消耗，营养不良可使大部分体细胞减少，导致患者免疫功能减退，当遭受到严重创伤、烧伤及手术病人，解剖生理机能遭受到损害，以致不能抗御感染。
社会老年人口增多，儿童保健事业的发展，老年和婴幼儿住院人数比例增多。老年患者除基础疾病外，往往并存有糖尿病、心血管病以及肝肾功能不全，使得病情危重而复杂，势必增加了患者住院日期，增加了诊断技术程序与多方式的监测手段，这些都无疑会损害患者的防御屏障体系。婴幼儿机体的免疫防御系统尚未完全发育成熟，更容易受到内外环境的伤害，增加了感染机率。感染人类免疫缺陷病毒(HIV)者，最终必然发生机会性感染或院内感染。
二、侵人性诊疗与监测
现代医学工程学、生物医学以及临床影像学的发展，患者接受带有侵入性诊疗与监测的机遇显著增多，概括有各组织、脏器的外科手术；暂时或长时期的动静脉插管；体腔或消化腔各类置管装置、不同类型的气管插管；各种内镜的检查与治疗；各组织脏器的穿刺置管等，介入性操作必然干扰或损害到机体的防御屏障，或因无菌操作不规范，将病原微生物直接带入到组织器官内，引起感染。血液透析、癌症的化疗、血流动力学参数的监测、输液复苏、静脉给药、采取血样等，导管装置的腔壁常被凝固酶阴性葡萄球菌、白色念球菌所定居，不易被抗菌素清除，引起导管出口感染、导管邃道感染、皮下埋藏输液囊内腔感染，以及肺部、体腔等感染。
三、抗菌素大量广泛使用
抗菌素可以治疗感染性疾病，但也能够带来再感染性损害，由于各类新型抗菌素在社会上广泛出售与普遍使用，又没有完善的监控管理，抗菌素的滥用必然会造成了耐药细菌及新的病原菌出现并迅速蔓延。这些耐药菌和新出现的病原菌对医院内人员构成严重威胁。文献报告医院发生耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的流行。现已发现有的耐药菌株对十余种常用抗菌素产生耐药且呈独霸的局面。目前肠球菌属已分出13种，能引起泌尿道感染、伤口感染，腹内脓疡、败血症和心内膜炎等。在美国CDC资料，肠球菌已成为院内感染第三位致病原，近年肠球菌对多种抗菌素具有显著耐药性，而且这种耐药程度已逐渐扩展到用于治疗该菌感染的主干药物。如苄青霉素、氨苄青霉素、氨基糖甙类和万古霉素。肠杆菌已取代克雷伯氏菌，成为引起医院内获得性革兰氏阴性菌感染的主要病原菌，尤其是在监护病区患有恶性肿瘤、糖尿病以及各类手术后患者，引起感染的重要原因是滥用广谱头孢菌素，特别是高效广谱头孢菌素与其它β-内酰胺类一起应用时更为突出。肠杆菌属细菌具有能灭活所有头孢菌素的头孢菌素酶，这种酶在正常情况下不表达，但细菌与其任一种头孢菌素接触就能诱发产生，肠杆菌一旦被触发产生这种酶，就会导致对多种β-内酰胺类抗菌素耐药。绿脓杆菌是一种问题很多的院内感染病原体，由绿脓杆菌引起的菌血症、肺炎、骨髓炎和心内膜炎的治疗失败率和病死率明显高于其它病原体的感染，其原因是绿脓杆菌对多种抗菌素不敏感，以及体外敏感试验及协同试验的结果，不能引伸作为临床疗效的依据。金黄色葡萄球菌院内感染依然是棘手的问题，结合我国资料，1990～1992年在929株金黄色葡萄球菌中有425株 (45．?％)是耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)。从 660例住院病人分离出的金黄色葡萄球菌中50．9％是MR— SA。从269例门诊病人分离的金黄色葡萄球菌中33．1％是 MRSA。在425株MRSA中有45％对环丙氟哌酸耐药，而在 504株对甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌中耐环丙氟哌酸的MRSA其中86．5％是从医院获得的，而且金黄色葡萄球菌对环丙氟哌酸的耐药性菌株正迅速增多。凝固酶阴性葡萄球菌(SCN)除一株外均对青霉素。甲氧苯青霉素抗药，53％对苯唑青霉素抗药。这些无疑使院内感染的控制带来困难。临床常用红霉素作为青霉素过敏患者一线抗菌药治疗A族链球菌(groupAstreptococci，GAS)感染性疾病，然而北京儿童医院1994年报告，临床分离GASll4株，耐红霉素菌株占 66．7％，其中有43。7％呈重度耐药，这一结果同以往国内报道相比有成倍数增加，并高于国外文献报告。长期以来临床不加区别滥用抗菌素，造成耐药菌株增多与播散。近期美国分离的多药抗性肺炎链球菌与南非和欧洲的菌株相同，这表明曾是地理上局限区域分布的抗菌素耐药菌株已在世界范围播散。
临床大剂量长时间使用广谱抗菌素，尤其是二种或三种抗菌素联合使用，除致病敏感菌被杀死或抑制外，身体内常驻菌群中敏感菌也受到抑制或清除，以致造成体内常驻菌种类、数量和定植部位的紊乱，这种菌群失调，包括有厌氧菌与需氧菌、耐药菌株与敏感菌株、常驻菌与非常驻菌之间比例失调。大量繁殖的优势菌多是耐药菌或真菌。常态下体内菌群受到    宿主与环境的变化而失去平衡状态，但绝大多数情况下，宿主经过自我调节和防御能力的作用，失衡状态很快消失。如果菌群失调持续存在，就会导致细菌易位，尤其是肠道内细菌穿过肠粘膜上皮进入肠外组织，到达肠系膜淋巴结、肝、脾、肺，肾等脏器和血液，成为内源性感染。
第三代头孢菌素是目前最大的一族广谱高效抗菌素，这类药除对肠球菌无效，对厌氧菌抗菌作用较差外，对其他致病菌。尤其是革兰氏阴性杆菌都有强大的抗菌性，如果大剂量长期使用或滥用这族药物，敏感菌受到抑制或清除，而未被抑制菌则可乘机繁殖，引起二重感染，特别是继发性消化道、呼吸道，泌尿系、腹腔内的真菌感染。
四、病人与院内工作人员接触次数增多
每一个医疗单元病区，住院者约有35—50人，每一位住院患者要与专业病区的实习、住院、总住院、主治、主任等4～ 5个层次的医师密切接触，接受他们各种检查与治疗，同时还要接受病区内15～20名护理人员的治疗与生活护理。另外每二位患者还要接受专业病区外的检验、放射，B超、麻醉等4—5个辅助诊疗单元的医护人员的各项辅助检查与诊疗实施。每个病区建筑结构多是直桶式，活动空间窄小，人员过度拥挤，如果感染控制措施不能确切实施，如最容易做到，也是预防感染传播有效的洗手制度不能形成习惯行为，这些医护人员也会成为院内感染的传播者。
五、病人活动范围扩大
医院在环境、生活服务、心理服务等方面不能适应病人的要求。探视制度、陪员制度管理不完善，促使住院患者在医院内活动范围扩大，病人之间以及与社区人员的相互接触频繁数目增多，这种状况必然影响到医院内获得性感染的流行与向社区散布。
六、感染管制方案不能确切实施
医院领导决策人，对院内感染理解不深、认识不足、重视不够，没有将院内感染管制列入医院质量管理主要组成。院内感染管理组织机构不完善，组织成员素质差，专业知识水平低，没有权威性，不能开展日常工作，院内感染监视程序无章可循，不能有效实施，院内感染管制教育与培训制度不落实，使得院内感染管制制度实施不利。
第三节        医院感染微生物的监测技术
医院感染微生物监测任务，最好由监测实验室来完成，也可由临床细菌学实验室担任。但必须加强临床细菌学实验室的力量。
目前，实验室对医院感染微生物的监测，尚无一套完整而系统的监测方法。由于医院感染涉及因素很多，即使监测实验室条件较好，也不可能都一一做出检查。仅就微生物种类的鉴定和检查技术的某一方面，即可成为一本专著，现仅就实验室的一般监测方法加以概述。
一.样品的采集
1.采样原则：测定物品污染程度或考核消毒措施的效果，都以样品中所含微生物的数量来计算，因此样品采集要有代表性，有一定的数量和固定的采样部位，为避免样品的再污染和腐败变性，必须尽快进行各种检测试验，送检时间不得超过6小时，若样品保存于0-4℃则不超过24小时。
2.样品种类：①光滑物体表面：指针对液体无声头性的表面；②多孔物体表面；②空气介质。④手指皮肤；⑤液体样品。
3.采样方法：
①光滑物体表面的采样：每次以5×5cm2的标准灭菌规格板，放在被检物体表面，根据物体表面大小，采样1—4个，用浸有无菌稀释液的棉拭子在规格板内来回均匀涂抹整个方格内各部位，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子放入5ml稀释液或含有相应中和剂的稀释液的试管内振打30次，作适当稀释后，接种于普通琼脂平板上，进行活苗计数，每个释释度作平行样品2—3个，计算被检物体表面污染微生物的数量，或判断消毒措施的效果。门把手等小型物体用采样棉拭子涂抹物体的整体，以每件为单位计算。较大门把手则按面积(cm2)计算。
②多孔物体表面的采样；纸张、纺织品、皮毛等物体用无菌方法取样品2克将其剪碎，加入20m1的稀释液内，敲打振荡80次，土壤标本取样2—5克，在20—50m1稀释液内充分混匀并敲打80次，使采样液中样品名然沉降，取上清液作适当稀释进行活菌计数，求出每克被检样品中含活菌的数量。
③空气采样：采用平板暴露法。室内面积小于30m2的房间，至少设3个采样点，30m2以上房间应设5个取样点(东、西、南、北、中)，高度为1.5米。取其每立方米空气含有细菌的均数。空气样品应做细菌总数(普通营养琼脂)和链球菌(血平板)计数。
④手的采样：被检人五指并拢，将浸有无菌稀释液的棉拭子在双手指屈面从指根到指端来回涂擦各两次，并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭于放入5ml稀释液的试管内，振打80次，、采样液作适当稀释后接种平板。
⑤液体样品的采集：水污染程度的测定：根据水污染程度情况的不同，选择适当稀释度接种平板，培养于36±1℃或28℃温箱48小时后计算每毫升中活菌数。
消毒剂使用中污染菌量测定：被检消毒液混匀后，用无菌吸管取样1ml加入9ml含相应中和剂的稀释液内，混匀后取0.5ml接种平板培养于36±1℃ 3天和28℃ 7天，每次采样平均作3次样品计算每毫升消毒液在连续使用过程中污染微生物数量。
二.检测内容
1.菌落总数测定
活茵计数法是微生物学鉴定物品污染程度和鉴定消毒效果的基本操作之一，活茵总数是指检样经一定处理和培养后所得单位重量(1克)或单位容积(1毫升)中活菌的总数。
(1)琼脂平板涂抹法操作步骤：
①将待测含菌液体充分振打混匀，用手敲打80次；②用1ml无菌吸管吸取菌液0.5-1ml加入第一支稀释管4.5-9ml内，振打混匀；②另取一支无菌吸管按上项操作顺序再作10倍稀释，直到所需的稀释倍数，每递增稀释一次，换一支无菌吸管；④根据对样品污染程度的估计，选择2或3个适宜的稀释度分别在作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度吸管移出0.2ml带菌稀释液接种于事先在36±1℃温箱烘烤30分钟的普通琼脂平板表面，并涂布开，放36±l℃温箱培养48小时，或用倾注琼脂平板法培养；⑤计数平板表面的菌落数，每份样品需重复3—5次试验。
(2)琼脂平板倾注法操作步骤：
①含菌液体稀释方式与琼脂涂抹法相同。
②取适当稀释度的菌液0.5-1.0ml加入无菌空平皿内。
③将溶化并保温在45-48℃的营养琼脂向每个已接种菌液的平皿内倾注15-18m1，边倾注边摇匀；④琼脂倾注后，翻转使平皿底朝上，置37℃温箱培育48小时，计数菌落数。
(3)判断结果：
①一般用肉眼观察，必要时用放大镜检查，先记下各平板上的菌落数，再求出同一稀释度平板上生长的平均菌落数，选取菌落数在30-300个之间的平板作为菌落总数测定的标准，每个稀释度使用2-3个平板分别求出平均数；②未经稀释的原液在平板上生长不足30个者，亦应计数，将计数结果换算成每毫升原液的菌落数；②若有两个稀释度平板上生长的菌落数均在30-300个之间，应报告两种稀释度菌落数的均数；④若有一个平板菌落不到平板面积的一半，而其余一半中菌落分布均匀时，可计算半个平板菌落数乘以2，代表全平板菌落数；⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300个之间应作废；⑥平板间或同一稀释度间的误差率超过10％者均应作废；⑦误差率计算。
菌落数在100个以内时，按其实有数据报告，大于100个时，采用两位有效数字，在两位有效数以后的数值以四舍五入的方法计算。也可用10的指数来表示。
2.快速分离及签定细菌
(1)重视培养前的直接镜检：
直接涂片镜检既可作为培养指向的参考；还可初步估计标本中的细菌总数及种类，有时在培养标本中含有一定浓度的抗菌物质，出现假阴性反应时，涂片中所见到的细菌则有重大的诊断价值。这样可较快取得对临床有用的信息。
(2)将一级细菌的鉴定，结合在分离细菌的各步骤中。
为了防止漏检和误诊，应按常规方法操作。但为了能尽早向病房提供治疗及预防措施，也需要尽快提供资料。因此常需将各种鉴定尽量向前提。方法可在标本初次接种的平板上，根据临床情况、标本种类、常见病原菌，贴上临床可使用的抗生素纸片。第二天在观察分离培养结果的同时，即可得出抗生素敏感试验的初步结果。
三．高压蒸气灭菌质量的微生物学监测
1.操作方法
(1)将嗜热脂肪芽胞杆菌菌片(106cfu／片)装入无菌空试管内。盖紧管口，置高压蒸气锅5个点中。
(2)待高压蒸气灭菌后，装入5ml灭菌肉浸汤培养基中，置56℃恒温箱或水浴箱中培养24-48小时。
2.观察结果
(1)培养液呈鲜黄色并混浊，判为有菌生长，表示压力蒸气未达到灭菌要求；若培养液不变色，液体澄清透明，判无菌生长，则表示已达到灭菌要求。
(2)培养的同时接种一片不经灭菌处理的指示菌片，作有菌生长的对照。
(3)建立监测结果登记：包括监测时间，菌株放置的位置，监测人姓名，清毒效果等；如发现灭菌效果不符合要求时，必须及时查明原因，及时处理。
第四节        医院感染微生物监测常用培养基配方
一般细菌可用营养肉汤和营养琼脂。真菌用沙氏培养基。
营养肉汤配制：蛋白陈川g1牛肉资5g、氯化钠58，加蒸馏水1000ml。加热熔解，调pH至7.4-7.6，滤纸滤过，分装。压力蒸气115℃持续30分钟灭菌备用。
营养琼脂配制：每100ml营养肉汤加1.5-2.0g琼脂，加热熔解，调pH至7.4-7.6，过滤分装。压力蒸气灭菌备用。
沙氏培养基配制：葡萄糖20g，蛋白胨10g加蒸馏水至1000ml，溶解后调pH至5．6即成沙氏肉汤。过滤分装，压力蒸气灭菌备用。
沙氏平板配制：每100m1沙氏肉汤加琼脂2g，加热熔解，调pH至5.6，压力蒸气115℃持续30分钟灭菌后备用。
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已浏览 336 次 编辑：王琛  更新日期：2008-11-22
第六章  医院感染的流行病学与病原学
流行病学是研究人类疾病流行与决定健康的因素，借此找出疾病的起因，疾病传播的途径，人类易感因素以及环境状态，即是人体、病原与环境平衡相关因素。
第一节  医院内感染病原微生物的来源
一、外界环境病原微生物
1．医院环境、医院建筑面积及各诊疗单位结构分布是否有利于感染管制，应注意并慎防医院病房、走廊的地面、门窗、废弃污物、供水及膳食等病原微生物的状况。病人所需的生活各种用具与物品、医疗设备器械以及日常诊疗所用的静脉输液器、各种体腔引流管等是否有潜在病原存在。
2．院内其他住院病人或医护工勤人员患有活动性疾病，或正处于疾病的潜伏期，或他们就是带菌者。
二、内源性病原微生物
在正常状况人体口咽部、呼吸道、肠道、生殖泌尿道等部位都有细菌寄生繁殖，这些细菌多数是非致病菌，其中部分是条件致病菌，少数是致病菌，它们相互制约与宿主维持平衡状态不引起发病。流行病学调查表明，院内感染病原微生物多是革兰氏阴性杆菌，尤其是肠杆菌属所引起，其感染源多是来自体内正常寄居菌群，肠道是人体内寄居菌最大的细菌库，是内源性感染主要的隐性感染源。正常的机体状态，肠道能够保护宿主免受肠内细菌及其毒素入侵，当肠屏障功能遭受到损害或某种因素如长期大量使用广谱抗菌素、较长时期的胃肠外营养等引起肠内菌群失调，就可导致肠腔内细菌或毒素穿出肠壁进入淋巴、血流或非正常定居的组织、脏器，引起肠源性感染。这种自身性感染已成为当代院内感染所关注的课题。
第二节  院内感染传播方式
一、接触感染
接触感染是传统院内感染常见的传染方式，可分为如下几种情况：
1．直接接触：通过相互之间直接接触传播病原微生物。如医护人员的手将各种病原微生物由甲病人带到乙病人，引起乙病人发病，经手部带的病菌有葡萄球菌、链球菌及一些革兰氏阴性菌如肠杆菌属等。
2．间接接触：由污染的诊疗器械设备、敷料以及日常生活用品如餐具、衣物等将致病原传染给易感宿主。目前常见的有静脉插管、各种穿刺引流、内镜、导尿、呼吸器等侵入性诊疗方法所造成的院内感染。
3．口沫传染：含病原微生物的飞沫，经由咳嗽、谈话在30  厘米之内传入易感宿主鼻咽口而引起的感染，如脑膜炎、肺炎、百日咳、腮腺炎、流感等。
二、空气传播
病原微生物附着在空气中飞扬较高的飞沫颗粒、尘埃中，这些微细的颗粒可以漂浮1米以外，并在空气中漂浮较久，吸入此种空气就可以引起感染，如结核、风疹、麻疹、猩红热等。
三、媒介传染
被病原微生物污染的食物、水、静脉输注的液体、血液以及某些血清药品传给人体，如病毒性肝炎，军团菌病及沙门氏菌属、肠杆菌属、真菌等引起的院内感染疾病。
四、病媒感染
媒介昆虫叮咬引起的传染性疾病，如受虱或蜱叮咬传播的病原螺旋体引起的回归热，传播普氏立次体引起的流行性斑疹伤寒，由蚊叮咬传播疟原虫引起的疟疾，传播虫媒病毒引
起的黄热病等。
五、细菌易位(Bacteriatranslocation)
是指人体内正常定居部位的常驻菌群中某一菌种迁移到非正常定居的无菌组织或器官，引起感染性病变，导致细菌易位的因素有菌群失调(Dysbaeteriosis)、栖居于人体的菌丛中  细菌的种类、数量和定植抗力(Colonizationresistance)发生紊乱。轻度菌群失调经过人体自身调节和免疫防御能力的增强，菌种间失衡状态很快消失，机体并不会受到很大的影响和损害。如果出现严重菌群失调，优势菌大量繁殖，这些多是耐药菌株或是条件致病菌出现易位对机体可造成一系列的病理、生理改变。促发细菌易位另一些因素是身体的解剖与生理防   御屏障受到损害。
第三节  医院内获得性感染的部位与菌种
一，医院内感染的频率与部位
影响医院内感染发生的频率与部位的因素是诸方面的，与医院的性质、住院病人的年龄、住院时基础病的严重程度、介入性治疗与监测装置、抗菌药物、免疫抑制药使用的范围，以及是否有并存性疾病，还与医院建筑结构、地面、空间开阔程度、医院各诊疗单元的分布、工作流程以及医院工作人员的素质等有关。上海华山医院1985—1987年院内感染年发病率是  13．1％，感染部位发病情况是肺部占45．2％、尿路为18％、伤口10％、肝胆道7．5％、败血症为5％、皮肤、腹腔、胃肠道等感染发生率均低于5％。院内感染危险度单因素分析证实年龄在65岁以上、胆管引流、留置导尿、气管切开及气管插管、结缔组织病、危重疾病、应用免疫抑制剂、慢性疾病、损伤性操作、伤口引流、污染手术、多种抗菌素使用等十二项具有重要性。1993年美国医院获得性感染统计资料，年院内感染率是3．35％，感染发生部位依次是泌尿道感染38％、下呼吸道感染18％、外科伤口感染17％、皮肤组织感染和因静脉导管或血管内插管所致的菌血症各占6％和8％、其他部位总数是 13％。台湾长庚医院资料1988—1990年，院内感染年发生率是2．4％，泌尿道感染占首位是41％、血流感染18％，伤口感染12。3％、下呼吸道感染占11。8％。台湾荣民医院年院内感染率是3．71％，泌尿系感染占院内感染病例31．9％、外科伤口感染占17．?％、血流感染15．8％、呼吸道感染14，6％。泰国曼谷1991年资料，院内感染年总发病率是11．7％，以5-15岁占比例最大，各科室发生情况是在加强监护病房 (ICU)，院内感染率是35％，骨科发病20.4％、普通儿科 15．7％、新生儿监护区36．5％、外科发病14。6％。兰医二院普通外科1994年院内感染统计资料，院内感染总例数是139例，年发病率是14．6％，呼吸道感染占院内感染总数的 59．72％、外科伤口感染占17．26％，因静脉输液，静脉插管所致的软组织及静脉炎、腹腔胃肠道感染、胆管引流感染、泌尿道感染等发生率均低于3％，持续较长时间的输液反串者占 9．35％。
二、院内感染最常见的微生物
引起院内感染的常见病原是肠源性肠杆菌、肠球菌、耐药菌株以及条件致病菌、霉菌和病毒。近30年由于临床医学、临床药物学越来越精湛发展，危重病例被抢救成功率日增，这些患者经常需要应用各种高效广谱抗菌素以防治危及生命的各种感染，因此在这些监护治疗单元内耐药菌株和新的病原菌也不断出现。上海华山医院1985—1987年总计分离出院内感染菌株271株，革兰氏阴性杆菌180株，占总数66．4％，革兰氏阳性球菌62株，占22．9％，还有念珠菌与曲霉菌。美国疾病控制中心1982年资料，院内感染最常见的病原是大肠杆菌为 17．8％、绿脓杆菌11．4％、肠球菌10．4％，金黄色葡萄球菌 10．3％，1993年美国德克萨斯州休斯顿市圣路加医院资料，院内感染的病原是大肠杆菌为18．5％、克雷伯氏杆菌／肠杆菌为13。9％、粪链球菌13。3％、绿脓杆菌列在第四位，金黄色葡萄球菌，念珠菌有逐升趋势，而脆弱类杆菌则稍有下降。台湾长庚医院院内感染病原资料是大肠杆菌占14．9％、绿脓杆菌12．2％、克雷伯肺炎杆菌9。4％、金黄色葡萄球菌8．6％、肠球菌6．2％。泰国曼谷医院内感染病原学资料是，绿脓杆菌占22.0％、大肠杆菌18．1％、克雷伯杆菌14。0％。兰医二院普外科院内感染最常见的病菌是肠杆菌属。由此可见革兰氏阴性菌是院内感染的主要菌种。
1．泌尿道感染最常见的致病菌。
美国疾病控制中心报告为大肠杆菌占30.0、肠球菌 14.7％、绿脓杆菌12.7％。台湾长庚医院报告资料是大肠杆菌占23.6％、绿脓杆菌占11.4％、克雷伯肺炎杆菌占 10.7％。
2．外科伤口感染致病菌。
CDC资料是金黄色葡萄球菌18.6％、肠球菌12.1％、大肠杆菌11.5％。台湾长庚医院资料是金黄色葡萄球菌为 26.7％、肠球菌11.4％、大肠杆菌21.5％、假单胞菌10.6％、克雷伯杆菌13．6％。
3．下呼吸道感染致病菌。
1985—1988年国内一组院内获得性肺炎病原体分析，革兰氏阴性菌58.7％，革兰氏阳性菌17.6％，白色念珠菌 3.7％。在革兰氏阴性菌中，绿脓杆菌占17.2％、肠杆菌 10.4％、肺炎克雷伯杆菌7．4％、大肠杆菌6．4％、沙雷氏菌 4．5％、奇异变形杆菌3.4％。革兰氏阳性菌中金黄色葡萄球菌14．6％、肺炎链球菌3．0％。CDC统计院内下呼吸道感染病原体资料绿脓杆菌占下呼吸道感染致病菌中16．9％、金黄色葡萄球菌占12．9％、克雷伯杆菌占11．6％。台湾荣民医院资料是以假单胞菌居首、克雷伯菌居次、金黄色葡萄球菌第三位、大肠杆菌居第四位。菲律宾资料是绿脓杆菌占54％、克雷伯杆菌是14％、不动杆菌为10％、肠杆菌属为9％。医院内获得性肺炎的病原不断演变，过去20年，革兰氏阴性杆菌是最常见的病原。随着第三代头孢抗菌素的应用，有些革兰氏阳性球菌感染又呈上升。华南地区一份资料，在302个痰标本中培养28种致病菌、277个菌株，厌氧杆菌占27．5％、肺炎双球菌 9．4％、流感嗜血杆菌9．4％、溶血性链球菌8．4％、克雷伯杆菌8．4％、绿脓杆菌8．9％。病人住院经常规抗菌素治疗后逐渐出现绿脓杆菌，在儿科病房呼吸道合胞病毒亦是小儿院内感染重要病原，呼吸道合胞病毒经患儿鼻分泌物排出，很容易在医院内传播，使医护人员及住院儿童获得感染。
4．血流感染致病菌。
CDC报告资料是凝固酶阴性葡萄球菌(coagulacenegative  staphylocacei—SCN)感染占14．9％、金黄色葡萄球菌占12．3％、大肠杆菌占10．1％。荣民医院的资料依次为大肠杆菌、克雷伯杆菌、绿脓杆菌。革兰氏阴性杆菌菌血症在老年组明显增多，其常见的侵入途径是泌尿生殖道、胃肠道、胆道和腹腔，患者基础疾病多是恶性肿瘤、多种手术、糖尿
28病等。最近20年，嗜中性白细胞减少的病人，菌血症的病原体种类发生了变化，1973年以革兰氏阴性菌为主占71％，到 1991年降至31％。以前认为是非致病性的革兰氏阳性菌所致的菌血症发生率逐年增加，念珠菌引起的血流性感染成为新兴的病原体。
第四节  医院内获得性感染的因素
影响医院内感染的危险因素：病人基础疾病的严重程度、免疫机能状态、介入性诊疗装置使用的范围、抗菌素使用的状况以及住院期限、医院工作人员的素质。院内感染发生率较高的区域，常见于患者免疫功能低下或防御机能受损的医疗单元。近20年由于临床医学、临床药物学、临床介入诊疗与监测技术的发展，使其一些致命性疾病患者获得较长时期的生存，这部分患者也必然需要较长时期的住院与监护，接受较为复杂的诊疗技术。此外，肿瘤的化学治疗或由于某种预防与治疗的需要，较大剂量与较长时间的使用免疫抑制剂、激素类药物，以及粒细胞减少患者等诸因素均会影响院内感染的发生。
一、生理机能减退，防御屏障受损
住院病人由于基础疾病造成机体的生理解剖机能明显减退，自身免疫防御体系受到严重干扰与损害。如癌症患者免疫·功能就受到抑制再接受全身性放疗、化疗必然普遍发生嗜中性自细胞减少，当粒细胞数下降至2000—1000／mm3时，感染率则会显著增加。在结缔组织病、肾脏病、器官脏器移植等患者，接受激素、免疫抑制剂治疗期，病人的免疫功能必然遭受到损害。有些患者因某种原因胃肠消化液、第三间隙体液大量丢失或不能经胃肠道进食，胃肠外营养支持不全，肝糖原、肌蛋白大量分解形成自身大量消耗，营养不良可使大部分体细胞减少，导致患者免疫功能减退，当遭受到严重创伤、烧伤及手术病人，解剖生理机能遭受到损害，以致不能抗御感染。
社会老年人口增多，儿童保健事业的发展，老年和婴幼儿住院人数比例增多。老年患者除基础疾病外，往往并存有糖尿病、心血管病以及肝肾功能不全，使得病情危重而复杂，势必增加了患者住院日期，增加了诊断技术程序与多方式的监测手段，这些都无疑会损害患者的防御屏障体系。婴幼儿机体的免疫防御系统尚未完全发育成熟，更容易受到内外环境的伤害，增加了感染机率。感染人类免疫缺陷病毒(HIV)者，最终必然发生机会性感染或院内感染。
二、侵人性诊疗与监测
现代医学工程学、生物医学以及临床影像学的发展，患者接受带有侵入性诊疗与监测的机遇显著增多，概括有各组织、脏器的外科手术；暂时或长时期的动静脉插管；体腔或消化腔各类置管装置、不同类型的气管插管；各种内镜的检查与治疗；各组织脏器的穿刺置管等，介入性操作必然干扰或损害到机体的防御屏障，或因无菌操作不规范，将病原微生物直接带入到组织器官内，引起感染。血液透析、癌症的化疗、血流动力学参数的监测、输液复苏、静脉给药、采取血样等，导管装置的腔壁常被凝固酶阴性葡萄球菌、白色念球菌所定居，不易被抗菌素清除，引起导管出口感染、导管邃道感染、皮下埋藏输液囊内腔感染，以及肺部、体腔等感染。
三、抗菌素大量广泛使用
抗菌素可以治疗感染性疾病，但也能够带来再感染性损害，由于各类新型抗菌素在社会上广泛出售与普遍使用，又没有完善的监控管理，抗菌素的滥用必然会造成了耐药细菌及新的病原菌出现并迅速蔓延。这些耐药菌和新出现的病原菌对医院内人员构成严重威胁。文献报告医院发生耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的流行。现已发现有的耐药菌株对十余种常用抗菌素产生耐药且呈独霸的局面。目前肠球菌属已分出13种，能引起泌尿道感染、伤口感染，腹内脓疡、败血症和心内膜炎等。在美国CDC资料，肠球菌已成为院内感染第三位致病原，近年肠球菌对多种抗菌素具有显著耐药性，而且这种耐药程度已逐渐扩展到用于治疗该菌感染的主干药物。如苄青霉素、氨苄青霉素、氨基糖甙类和万古霉素。肠杆菌已取代克雷伯氏菌，成为引起医院内获得性革兰氏阴性菌感染的主要病原菌，尤其是在监护病区患有恶性肿瘤、糖尿病以及各类手术后患者，引起感染的重要原因是滥用广谱头孢菌素，特别是高效广谱头孢菌素与其它β-内酰胺类一起应用时更为突出。肠杆菌属细菌具有能灭活所有头孢菌素的头孢菌素酶，这种酶在正常情况下不表达，但细菌与其任一种头孢菌素接触就能诱发产生，肠杆菌一旦被触发产生这种酶，就会导致对多种β-内酰胺类抗菌素耐药。绿脓杆菌是一种问题很多的院内感染病原体，由绿脓杆菌引起的菌血症、肺炎、骨髓炎和心内膜炎的治疗失败率和病死率明显高于其它病原体的感染，其原因是绿脓杆菌对多种抗菌素不敏感，以及体外敏感试验及协同试验的结果，不能引伸作为临床疗效的依据。金黄色葡萄球菌院内感染依然是棘手的问题，结合我国资料，1990～1992年在929株金黄色葡萄球菌中有425株 (45．?％)是耐甲氧苯青霉素金黄色葡萄球菌(MRSA)。从 660例住院病人分离出的金黄色葡萄球菌中50．9％是MR— SA。从269例门诊病人分离的金黄色葡萄球菌中33．1％是 MRSA。在425株MRSA中有45％对环丙氟哌酸耐药，而在 504株对甲氧苯青霉素敏感性金黄色葡萄球菌中耐环丙氟哌酸的MRSA其中86．5％是从医院获得的，而且金黄色葡萄球菌对环丙氟哌酸的耐药性菌株正迅速增多。凝固酶阴性葡萄球菌(SCN)除一株外均对青霉素。甲氧苯青霉素抗药，53％对苯唑青霉素抗药。这些无疑使院内感染的控制带来困难。临床常用红霉素作为青霉素过敏患者一线抗菌药治疗A族链球菌(groupAstreptococci，GAS)感染性疾病，然而北京儿童医院1994年报告，临床分离GASll4株，耐红霉素菌株占 66．7％，其中有43。7％呈重度耐药，这一结果同以往国内报道相比有成倍数增加，并高于国外文献报告。长期以来临床不加区别滥用抗菌素，造成耐药菌株增多与播散。近期美国分离的多药抗性肺炎链球菌与南非和欧洲的菌株相同，这表明曾是地理上局限区域分布的抗菌素耐药菌株已在世界范围播散。
临床大剂量长时间使用广谱抗菌素，尤其是二种或三种抗菌素联合使用，除致病敏感菌被杀死或抑制外，身体内常驻菌群中敏感菌也受到抑制或清除，以致造成体内常驻菌种类、数量和定植部位的紊乱，这种菌群失调，包括有厌氧菌与需氧菌、耐药菌株与敏感菌株、常驻菌与非常驻菌之间比例失调。大量繁殖的优势菌多是耐药菌或真菌。常态下体内菌群受到    宿主与环境的变化而失去平衡状态，但绝大多数情况下，宿主经过自我调节和防御能力的作用，失衡状态很快消失。如果菌群失调持续存在，就会导致细菌易位，尤其是肠道内细菌穿过肠粘膜上皮进入肠外组织，到达肠系膜淋巴结、肝、脾、肺，肾等脏器和血液，成为内源性感染。
第三代头孢菌素是目前最大的一族广谱高效抗菌素，这类药除对肠球菌无效，对厌氧菌抗菌作用较差外，对其他致病菌。尤其是革兰氏阴性杆菌都有强大的抗菌性，如果大剂量长期使用或滥用这族药物，敏感菌受到抑制或清除，而未被抑制菌则可乘机繁殖，引起二重感染，特别是继发性消化道、呼吸道，泌尿系、腹腔内的真菌感染。
四、病人与院内工作人员接触次数增多
每一个医疗单元病区，住院者约有35—50人，每一位住院患者要与专业病区的实习、住院、总住院、主治、主任等4～ 5个层次的医师密切接触，接受他们各种检查与治疗，同时还要接受病区内15～20名护理人员的治疗与生活护理。另外每二位患者还要接受专业病区外的检验、放射，B超、麻醉等4—5个辅助诊疗单元的医护人员的各项辅助检查与诊疗实施。每个病区建筑结构多是直桶式，活动空间窄小，人员过度拥挤，如果感染控制措施不能确切实施，如最容易做到，也是预防感染传播有效的洗手制度不能形成习惯行为，这些医护人员也会成为院内感染的传播者。
五、病人活动范围扩大
医院在环境、生活服务、心理服务等方面不能适应病人的要求。探视制度、陪员制度管理不完善，促使住院患者在医院内活动范围扩大，病人之间以及与社区人员的相互接触频繁数目增多，这种状况必然影响到医院内获得性感染的流行与向社区散布。
六、感染管制方案不能确切实施
医院领导决策人，对院内感染理解不深、认识不足、重视不够，没有将院内感染管制列入医院质量管理主要组成。院内感染管理组织机构不完善，组织成员素质差，专业知识水平低，没有权威性，不能开展日常工作，院内感染监视程序无章可循，不能有效实施，院内感染管制教育与培训制度不落实，使得院内感染管制制度实施不利。
第三节        医院感染微生物的监测技术
医院感染微生物监测任务，最好由监测实验室来完成，也可由临床细菌学实验室担任。但必须加强临床细菌学实验室的力量。
目前，实验室对医院感染微生物的监测，尚无一套完整而系统的监测方法。由于医院感染涉及因素很多，即使监测实验室条件较好，也不可能都一一做出检查。仅就微生物种类的鉴定和检查技术的某一方面，即可成为一本专著，现仅就实验室的一般监测方法加以概述。
一.样品的采集
1.采样原则：测定物品污染程度或考核消毒措施的效果，都以样品中所含微生物的数量来计算，因此样品采集要有代表性，有一定的数量和固定的采样部位，为避免样品的再污染和腐败变性，必须尽快进行各种检测试验，送检时间不得超过6小时，若样品保存于0-4℃则不超过24小时。
2.样品种类：①光滑物体表面：指针对液体无声头性的表面；②多孔物体表面；②空气介质。④手指皮肤；⑤液体样品。
3.采样方法：
①光滑物体表面的采样：每次以5×5cm2的标准灭菌规格板，放在被检物体表面，根据物体表面大小，采样1—4个，用浸有无菌稀释液的棉拭子在规格板内来回均匀涂抹整个方格内各部位，并随之转动棉拭子，剪去手接触部位后，将棉拭子放入5ml稀释液或含有相应中和剂的稀释液的试管内振打30次，作适当稀释后，接种于普通琼脂平板上，进行活苗计数，每个释释度作平行样品2—3个，计算被检物体表面污染微生物的数量，或判断消毒措施的效果。门把手等小型物体用采样棉拭子涂抹物体的整体，以每件为单位计算。较大门把手则按面积(cm2)计算。
②多孔物体表面的采样；纸张、纺织品、皮毛等物体用无菌方法取样品2克将其剪碎，加入20m1的稀释液内，敲打振荡80次，土壤标本取样2—5克，在20—50m1稀释液内充分混匀并敲打80次，使采样液中样品名然沉降，取上清液作适当稀释进行活菌计数，求出每克被检样品中含活菌的数量。
③空气采样：采用平板暴露法。室内面积小于30m2的房间，至少设3个采样点，30m2以上房间应设5个取样点(东、西、南、北、中)，高度为1.5米。取其每立方米空气含有细菌的均数。空气样品应做细菌总数(普通营养琼脂)和链球菌(血平板)计数。
④手的采样：被检人五指并拢，将浸有无菌稀释液的棉拭子在双手指屈面从指根到指端来回涂擦各两次，并随之转动采样棉拭子，剪去手接触部位，将棉拭于放入5ml稀释液的试管内，振打80次，、采样液作适当稀释后接种平板。
⑤液体样品的采集：水污染程度的测定：根据水污染程度情况的不同，选择适当稀释度接种平板，培养于36±1℃或28℃温箱48小时后计算每毫升中活菌数。
消毒剂使用中污染菌量测定：被检消毒液混匀后，用无菌吸管取样1ml加入9ml含相应中和剂的稀释液内，混匀后取0.5ml接种平板培养于36±1℃ 3天和28℃ 7天，每次采样平均作3次样品计算每毫升消毒液在连续使用过程中污染微生物数量。
二.检测内容
1.菌落总数测定
活茵计数法是微生物学鉴定物品污染程度和鉴定消毒效果的基本操作之一，活茵总数是指检样经一定处理和培养后所得单位重量(1克)或单位容积(1毫升)中活菌的总数。
(1)琼脂平板涂抹法操作步骤：
①将待测含菌液体充分振打混匀，用手敲打80次；②用1ml无菌吸管吸取菌液0.5-1ml加入第一支稀释管4.5-9ml内，振打混匀；②另取一支无菌吸管按上项操作顺序再作10倍稀释，直到所需的稀释倍数，每递增稀释一次，换一支无菌吸管；④根据对样品污染程度的估计，选择2或3个适宜的稀释度分别在作10倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度吸管移出0.2ml带菌稀释液接种于事先在36±1℃温箱烘烤30分钟的普通琼脂平板表面，并涂布开，放36±l℃温箱培养48小时，或用倾注琼脂平板法培养；⑤计数平板表面的菌落数，每份样品需重复3—5次试验。
(2)琼脂平板倾注法操作步骤：
①含菌液体稀释方式与琼脂涂抹法相同。
②取适当稀释度的菌液0.5-1.0ml加入无菌空平皿内。
③将溶化并保温在45-48℃的营养琼脂向每个已接种菌液的平皿内倾注15-18m1，边倾注边摇匀；④琼脂倾注后，翻转使平皿底朝上，置37℃温箱培育48小时，计数菌落数。
(3)判断结果：
①一般用肉眼观察，必要时用放大镜检查，先记下各平板上的菌落数，再求出同一稀释度平板上生长的平均菌落数，选取菌落数在30-300个之间的平板作为菌落总数测定的标准，每个稀释度使用2-3个平板分别求出平均数；②未经稀释的原液在平板上生长不足30个者，亦应计数，将计数结果换算成每毫升原液的菌落数；②若有两个稀释度平板上生长的菌落数均在30-300个之间，应报告两种稀释度菌落数的均数；④若有一个平板菌落不到平板面积的一半，而其余一半中菌落分布均匀时，可计算半个平板菌落数乘以2，代表全平板菌落数；⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30-300个之间应作废；⑥平板间或同一稀释度间的误差率超过10％者均应作废；⑦误差率计算。
菌落数在100个以内时，按其实有数据报告，大于100个时，采用两位有效数字，在两位有效数以后的数值以四舍五入的方法计算。也可用10的指数来表示。
2.快速分离及签定细菌
(1)重视培养前的直接镜检：
直接涂片镜检既可作为培养指向的参考；还可初步估计标本中的细菌总数及种类，有时在培养标本中含有一定浓度的抗菌物质，出现假阴性反应时，涂片中所见到的细菌则有重大的诊断价值。这样可较快取得对临床有用的信息。
(2)将一级细菌的鉴定，结合在分离细菌的各步骤中。
为了防止漏检和误诊，应按常规方法操作。但为了能尽早向病房提供治疗及预防措施，也需要尽快提供资料。因此常需将各种鉴定尽量向前提。方法可在标本初次接种的平板上，根据临床情况、标本种类、常见病原菌，贴上临床可使用的抗生素纸片。第二天在观察分离培养结果的同时，即可得出抗生素敏感试验的初步结果。
三．高压蒸气灭菌质量的微生物学监测
1.操作方法
(1)将嗜热脂肪芽胞杆菌菌片(106cfu／片)装入无菌空试管内。盖紧管口，置高压蒸气锅5个点中。
(2)待高压蒸气灭菌后，装入5ml灭菌肉浸汤培养基中，置56℃恒温箱或水浴箱中培养24-48小时。
2.观察结果
(1)培养液呈鲜黄色并混浊，判为有菌生长，表示压力蒸气未达到灭菌要求；若培养液不变色，液体澄清透明，判无菌生长，则表示已达到灭菌要求。
(2)培养的同时接种一片不经灭菌处理的指示菌片，作有菌生长的对照。
(3)建立监测结果登记：包括监测时间，菌株放置的位置，监测人姓名，清毒效果等；如发现灭菌效果不符合要求时，必须及时查明原因，及时处理。
第四节        医院感染微生物监测常用培养基配方
一般细菌可用营养肉汤和营养琼脂。真菌用沙氏培养基。
营养肉汤配制：蛋白陈川g1牛肉资5g、氯化钠58，加蒸馏水1000ml。加热熔解，调pH至7.4-7.6，滤纸滤过，分装。压力蒸气115℃持续30分钟灭菌备用。
营养琼脂配制：每100ml营养肉汤加1.5-2.0g琼脂，加热熔解，调pH至7.4-7.6，过滤分装。压力蒸气灭菌备用。
沙氏培养基配制：葡萄糖20g，蛋白胨10g加蒸馏水至1000ml，溶解后调pH至5．6即成沙氏肉汤。过滤分装，压力蒸气灭菌备用。
沙氏平板配制：每100m1沙氏肉汤加琼脂2g，加热熔解，调pH至5.6，压力蒸气115℃持续30分钟灭菌后备用。