实时定量PCR心得

字体: 小 中 大 | 打印 发表于: 2011-8-21 12:42    作者: 大仙    来源: 分析测试百科网

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• 大仙 (2011-8-21 12:43:37)

  请问楼主：
  你买了多少量的试剂盒，摸条件是否顺利，real time 到底好做吗？
  我一同学做real time 光摸条件就用去了100多次的试剂，试剂这么贵，呵呵，请多多指教。

• 大仙 (2011-8-21 12:44:09)

  我之前买了一个50次的试剂盒，做了两次曲线不漂亮就不做了，后来换了宝生物的，总共做了四个基因，一个内参，三个目的基因，200次就够了，所以有时试剂不好，你做多少次都很难调得好的。real-time做的好的话，结果比半定量的可靠得多，从结果可以看出不少内参到了20个循环就进入平台期，我们平时做半定量的时候都是用30个循环去做，所以结果差别很大。

• 大仙 (2011-8-21 12:45:47)

  尽管有些地方值得商榷，但鼓励大家分享心得。

• 大仙 (2011-8-21 12:46:20)

  终于把实验做完了，做的是相对定量法。想把自己做定量PCR写下来，和大家一起分享学习。
  1、首先要确定引物的溶解曲线，最好的是一个峰，而且TM值在80度以上，有人说太低可能是D二聚体，但我做过82度的也有D二聚体，所以一定要把产物跑电泳才能确定引物的特异性。
  
  產物的Tm并不規定一個標準的範圍，但儘量在80以上，主要還是要結合電泳結果來看。我做過Tm 79度的。
  
  2、配引物一定要在无菌操作台里，因为定量PCR要求比较高，一点污染都会出现非特异性扩增，我就试过引物污染，阴性对照出现扩增曲线。
  恩，磨刀不誤砍柴工。支持！
  
  3、确定引物后要确定模板的浓度，我觉得说明书说的都不准，最好是自己调，把内参和目的基因的CT值调到8到26之间，最低不超过30，太高难以分辨，太低出现非特异性扩增，低的情况溶解曲线也变成多个峰。
  
  這個，Ct在8肯定是不准的。ABI儀器自動生成閾值的計算方法是Ct 8-16。大的不要超過35最好，不過我做過Ct 38，電泳產物大小是正確的，數值也拿來用了。哎。
  
  4、要做阴性对照，有人说阴性对照是不加引物，有人说是不加模板，我觉得是后者比较好一点。
  
  陰性對照不加引物還是頭一次聽說。
  
  5、一定要把PCR后的产物跑电泳，因为你机子分辨不了你的产物的大小。我试过溶解曲线很漂亮，但跑出来电泳多条带。
  同感，我也遭遇過。很令人鬱悶、費解。
  
  6、有条件就做标准曲线。
  
  這個主要是看選擇什麽方法處理數據。
  
  7、好的试剂和引物对你的实验帮助大，假如做3次曲线不漂亮，建议换引物或者试剂，定量PCR的引物设计要求比普通PCR的高，建议让专业设计，我的是在宝生物设计的，不错。
  
  定量引物和普通引物設計上各有側重，不能籠統的說要求孰高孰低哈，沒有最好的，只有最適合的，哈哈。
  
  謝謝樓主分享經驗。

• 大仙 (2011-8-21 12:46:41)

  我也是初学实时定量PCR不久，当时感觉到没人指导的滋味，所以想把心得和大家分享一下，也有着抛砖引玉的意思，你的回帖让我获益良多。
  说明书上说阴性对照是不加模板，不加引物的说法是我听一个同学说有个香港的教授说起的，但经过我的考虑觉得是不加模板。
  我做的是相对定量，绝对定量要做标准曲线是无可置疑的啦，相对定量我看不少文献和丁香园里的帖子也建议做，一个是看重复性如何，如假如是10倍稀释的话，两者CT值应该是相差3.3吧，假如是2倍稀释，相差是1.二、可以确定哪个CDNA的浓度适合你的实验，诚如楼上所说，太高和太低的浓度都会影响实验结果，而对于CDNA又没有好的方法去测定浓度，所以需要实验中摸索。三、做内参和目的基因的标准曲线可以对照两者的斜率，看两者的扩增效率是否在10％左右，要不结果还要通过公式调整。
  对于引物的设计，我查了资料感觉自己还是见识短浅，非常同意楼上的意见。

• 大仙 (2011-8-21 12:47:14)

  關於模板添加量的問題，由於cDNA沒有辦法測濃度，只有從RNA，也就是反轉錄前開始調整。把RNA測OD算出濃度后統一調整到一致，然后在反轉錄，做實驗如果感覺不合適的話，可以同等倍數稀釋cDNA，這樣就不至於盲目的摸索模板添加量了，呵呵。
  
  對於一個新領域的茫然感，人人都體會過。那種無助感，甚至都不知道該如何提問。還是樓主仗義，懂得分享。佩服下。

• 大仙 (2011-8-21 12:47:50)

  我实验的完成离不开各位战友的帮助，因为我知道虽然知识对懂得的人是微不足道，但对初学者，寥寥几句提示都会让他们获益良多。我只是做着他们同样的事情。

• 大仙 (2011-8-21 12:48:06)

  看了两位前辈的心得体会，很是受教！我正在计划做real-time PCR，还在设计实验，两位的心得让我少走弯路了，谢谢两位！

• 大仙 (2011-8-21 12:48:48)

  楼主用的是什么方法？？什么内参

• 大仙 (2011-8-21 12:49:29)

  终于把实验做完了，做的是相对定量法。想把自己做定量PCR写下来，和大家一起分享学习。
  1、首先要确定引物的溶解曲线，最好的是一个峰，而且TM值在80度以上，有人说太低可能是D二聚体，但我做过82度的也有D二聚体，所以一定要把产物跑电泳才能确定引物的特异性。
  2、配引物一定要在无菌操作台里，因为定量PCR要求比较高，一点污染都会出现非特异性扩增，我就试过引物污染，阴性对照出现扩增曲线。
  3、确定引物后要确定模板的浓度，我觉得说明书说的都不准，最好是自己调，把内参和目的基因的CT值调到8到26之间，最低不超过30，太高难以分辨，太低出现非特异性扩增，低的情况溶解曲线也变成多个峰。
  4、要做阴性对照，有人说阴性对照是不加引物，有人说是不加模板，我觉得是后者比较好一点。
  5、一定要把PCR后的产物跑电泳，因为你机子分辨不了你的产物的大小。我试过溶解曲线很漂亮，但跑出来电泳多条带。
  6、有条件就做标准曲线。
  7、好的试剂和引物对你的实验帮助大，假如做3次曲线不漂亮，建议换引物或者试剂，定量PCR的引物设计要求比普通PCR的高，建议让专业设计，我的是在宝生物设计的，不错。
  希望大家指点，互相学习。
  
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  我准备做，想请教您，是否每个样品都要做标准曲线，还是所有样品做一个标准曲线？

• 大仙 (2011-8-21 12:50:53)

  谢谢yaoshan，我也是初学实时定量PCR不久，当时感觉到没人指导的滋味，所以想把心得和大家分享一下，也有着抛砖引玉的意思，你的回帖让我获益良多。
  说明书上说阴性对照是不加模板，不加引物的说法是我听一个同学说有个香港的教授说起的，但经过我的考虑觉得是不加模板。
  我做的是相对定量，绝对定量要做标准曲线是无可置疑的啦，相对定量我看不少文献和丁香园里的帖子也建议做，一个是看重复性如何，如假如是10倍稀释的话，两者CT值应该是相差3.3吧，假如是2倍稀释，相差是1.二、可以确定哪个CDNA的浓度适合你的实验，诚如楼上所说，太高和太低的浓度都会影响实验结果，而对于CDNA又没有好的方法去测定浓度，所以需要实验中摸索。三、做内参和目的基因的标准曲线可以对照两者的斜率，看两者的扩增效率是否在10％左右，要不结果还要通过公式调整。
  对于引物的设计，我查了资料感觉自己还是见识短浅，非常同意楼上的意见。
  
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  内参和目的基因都要做标准曲线吗，只做内参标准曲线可以吗？

• 大仙 (2011-8-21 12:51:16)

  不是每个样品都要做标准曲线。但是要做预实验，从多个样品中选择一个样品来作为标准品进行标准曲线的制备，这个标准品要具备的条件是：目的基因和管家基因的Ct值均偏小。
  内参基因和目的基因都要做标准曲线，因为未知样品也要同时考察内参和目的基因，只有在各自的标准曲线上才能获得各自的浓度。

• 大仙 (2011-8-21 12:51:44)

  做绝对定量的话每块板都要做标准曲线，因为你要通过标准曲线来确定你的样品浓度。
  做相对定量的话，只要要对每个目的基因和管家基因做一次标准曲线，这是为了确定基因的扩增效率。

• 大仙 (2011-8-21 12:52:17)

  弱弱的问一句，相对定量做内参和目的基因的标准曲线到底有哪几方面的作用呢？我也刚做real time，好多东西还不懂，期待各位的回答，谢谢