工业微生物育种的基本原理（3）

来源：青岛海博
三、 基因重组 基因重组是指两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。基因重组时，不发生基因突变，而是整个基因的水平转移，导致受体细胞获得该基因并表现其性状。基因重组是核酸分子水平上的概念，是遗传物质分子水平上的杂交。细胞水平上的杂交必然包含有分子水平上的重组，而重组则不仅限于杂交一种形式。真核微生物可通过有性杂交、准性杂交和原生质体融合等进行整套染色体的重组；原核微生物主要经转化、转导、接合和原生质体融合等途径实现部分染色体或个别基因的重组。基因重组可以在人为设计的条件下发生，使之服务于人类育种的目的。   （一）、原核微生物的基因重组 在原核微生物中，基因重组主要有转化、转导、接合和原生质体融合4种形式。 1、转化 受体菌直接吸收来自供体菌的DNA片段，通过交换将其整合到自己的基因组中，从而获得了供体菌部分遗传性状的现象称为转化。通过转化方式而形成的杂种后代，称为转化子。转化因子指有转化活性的外源DNA片段。它是供体菌释放或人工提取的游离DNA片段。 转化因子需具备两个条件，较高的相对分子质量和同源性。相对分子质量一般在1×10⁷，以双链较多，单链者少见。供体菌和受体菌亲缘关系越近，DNA的纯度越高，越易转化。 两个菌种或菌株间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的联系。但即使在转化频率极高的菌种中，不同菌株间也不一定都可发生转化。能进行转化的细胞必须是感受态的。受体细胞最易接受外源DNA片段并实现转化的生理状态称为感受态。处于感受态的细胞，其吸收DNA的能力，有时可比一般细胞大一千倍。感受态的出现受该菌的遗传性、菌龄、生理状态和培养条件等的影响。感受态可以通过CaCl₂诱导。   2、转导 通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。由转导作用而获得部分新遗传性状的重组细胞，称为转导子。 转导现象在自然界中比较普通，它在低等生物进化过程中很可能是一种产生新基因组合的重要方式。   （1）普遍转导 通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称为普遍转导。噬菌体侵入寄主细胞后，通过复制和合成，亦将寄主DNA降解为许多小片段，进入装配阶段。正常情况下，噬菌体将自身的DNA包裹在衣壳中，但也有异常的可能。它误将寄主细胞DNA的某一片段包裹进去。这样的噬菌体称缺陷噬菌体。体内仅含有供体DNA的缺陷噬菌体称完全缺陷噬菌体。体内同时含有供体DNA和噬菌体DNA的缺陷噬菌体称为部分缺陷噬菌体。当包裹有寄主DNA片段的噬菌体释放后，再度感染新的寄主，其中的供体菌的DNA片段进入受体菌，并通过基因重组使受体菌形成稳定的转导子。 普遍转导又可分为以下两种：   A、完全普遍转导 简称完全转导（completetransduction）。指供体菌的任意DNA片段都可以进行转导。   B、流产普遍转导 简称流产转导（abortivetransduction）。经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，如果外源DNA在其内既不进行交换、整合和复制，也不迅速消失，而仅进行转录、转译和性状表达，这种现象就称流产转导。发生流产转导的细胞在其进行分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因经转录、转译而形成的少量产物——酶，因此在表型上仍可出现轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次“稀释”。所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就成了流产转导子的特点。   （2）．局限转导 局限转导最初于1954年在E．coliK12中发现。指通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。它有这样几个特点：①只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）；②该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带；③缺陷噬菌体是由于其在形成过程中所发生的低频率 “误切”，或由于双重溶源菌的裂解而形成，在后一情况下可形成50％缺陷噬菌体。E.coliK12的λ噬菌体可进行局限转导。根据转导频率的高低可把局限转导分成两类：   A、低频转导（LFT，lowfrequencytransduction）： 已知当温和噬菌体感染受体菌后，其染色体会开环，并以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，并获得对相同温和噬菌体的免疫性。如果该溶源菌因诱导而发生裂解时，就有极其少数（～10^-5）的前噬菌体发生不正常切离，其结果会将插入位点两侧之一的少数宿主基因（如E．coliλ前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的gal基因或合成生物素的bio基因）连接到噬菌体DNA上（而噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的染色体组上），通过衣壳的“误包”，就形成了一种特殊的噬菌体——缺陷噬菌体（defectivephage）。在E．coliK12中，可形成λdga1或λdg（带有供体菌gal基因的λ缺陷噬菌体，其中的“d”表示缺陷）或λdbio（带有供体菌bio基因的λ缺陷噬菌体），它们没有正常λ噬菌体所具有的使宿主发生溶源化的能力。当它感染宿主细胞并整合在宿主的核基因组上时，可使宿主细胞成为一个局限转导子（即获得了供体菌的gal或bio基因），而不是一个溶源菌，因而对λ噬菌体不具有免疫性。 由于宿主染色体上进行不正常切离的频率极低，因此在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例是极低（10^-4～10^-6）的，这种裂解物称LFT（低频转导）裂解物。LTF裂解物在低m．o．i（感染复数）情况下感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，这就是低频转导。   B、高频转导（HFT，highfrequencytrans-duction）：当E．coligal-（不发酵半乳糖的营养缺陷型）这种受体菌用高m．o．i的LFT裂解物进行感染时，则凡感染有λdga1噬菌体的任一细胞，几乎同时都感染有正常的λ噬菌体。这时，λ与λdga1两者同时整合在一个受体菌的核染色体组上，从而使它成为一个双重溶源菌。当双重溶源菌被紫外线等诱导时，其中的正常λ噬菌体的基因可补偿λdga1所缺失的部分基因功能，因而两种噬菌体就同时获得复制的机会。所以，在双重溶源菌中的正常λ噬菌体被称为助体（或辅助）噬菌体（helperphage）。根据以上的特点可以知道，由双重溶源菌所产生的裂解物中，含有等量的λ和λdga1粒子，这就称HFT（高频转导）裂解物。如果用低m．o．i的HFT裂解物去感染另一个E．coligal-受体菌（不能发酵半乳糖的受体菌）的话，则可高频率地把它转化为能发酵半乳糖的E．coligal+转导子。这种方式的转导，就称高频转导。   （三）接合 供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者 获得若干新遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新遗传性状的受体细胞称为接合子。 细胞的接合现象在大肠杆菌中研究得最清楚。大肠杆菌有性别分化，决定它们性别的因子称为F因子(即致育因子或性质粒)。F因子是一种独立于染色体外的小型的环状DNA，一般呈超螺旋状态，它具有自主的与染色体进行同步复制和转移到其他细胞中去的能力。F因子既可脱离染色体在细胞内独立存在，也可整合到染色体组上；它既可经过接合作用而获得，也可通过一些理化因素(如吖啶橙、丝裂霉素、利福平、溴化乙锭和加热等)的处理而从细胞中消除。 F^＋菌株可以与不含F因子的F^－菌株接合，从而使后者也成为F^＋菌株，其过程大体可分两个阶段：首先是F^＋菌株与F^－菌株配对，并通过性菌毛接合；然后F因子双链DNA的一条单链在一特定的位置断开，通过性菌毛内腔向F^－菌株细胞内转移，并同时在两个菌株细胞内以一条DNA单链为模板，各自复制合成完整的F因子。 有些大肠杆菌的F因子可与核染色体整合在一起，这种类型的菌株与F^－菌株接合的重组频率比F^＋与F^－菌株接合的重组频率高几百倍以上，因此，常将其称为高频重组(Hfr)菌株，Hfr与F^－菌株接合时，染色体的一条单链可以在F因子处断裂，并以F因子为末端向F^－菌株胞内转移。由于转移的过程中常发生染色体的断裂，所以这种接合可以使F^－菌株获得部分供体基因，但很少使F^－菌株获得F因子。 Hfr菌株中的F因子有时可由不正常的切割而带有一小段核染色体基因的杂合F因子，通常称为F′因子，当带有F′菌株与F^－菌株接合后，可使F^－菌株成为既有F因子又带有部分供体菌基因的次生F′菌株。   （四）原生质体融合（protoplastfusion）通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（fusant）的过程，称为原生质体融合。原核生物的原生质体融合研究是在70年代后期才发展起来的一种育种新技术，这是继转化、转导和接合之后一种更有效的转移遗传物质的手段。能进行原生质体融合的细胞是极其广泛的，不仅包括原核生物中的细菌和放线菌，而且还包括各种真核生物的细胞，例如属于真核微生物的酵母菌和霉菌以及高等动植物和人体的不同细胞。 　　原生质体融合的主要步骤是：先选择两个有特殊价值的并带有选择性遗传标记的细胞作为亲本，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶（如细菌或放线菌可用溶菌酶或青霉素处理，真菌可用蜗牛酶或其他相应的脱壁酶等）去除细胞壁，再将形成的原生质体（实际上往往是些脱壁不完全的球状体）进行离心聚集，并加入促融合剂PEG（聚乙二醇polyethyleneglycol）或通过电脉冲等促进融合，然后在高渗溶液中稀释，再涂在能使其再生细胞壁和进行分裂的培养基上。待形成菌落后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，鉴定它们是否为融合子，最后再测定其他生物学性状或生产性能