琼杰特被谁杀的:茶黄素抗癌作用机理

茶黄素抗癌作用机理
作者：屠幼英 作者单位：浙江大学茶学系       关于化学致癌过程有许多假说，现在比较公认的是三阶段致癌学说，即启动、促进和进展。一般认为在启动阶段，致癌物在体内经代谢活化形成亲电性的终致癌物，与细胞核DNA结合，引起DNA损伤而导致细胞突变；然后在促进阶段，细胞分裂时DNA损伤传给子代得以固定，这一阶段是启动细胞克隆后连续增殖的过程；随后，进一步发展至癌前病变和癌变，即进展阶段（图1）。在这个传导的过程中只要阻断其中一个环节就可抑制肿瘤产生。国内外学者进行了大量研究，提出了许多可能阻断肿瘤产生的机理，包括:通过捕获自由基、阻断过氧化及DNA损伤而发挥抗氧化作用；选择性诱导I、II期代谢酶，促进致癌剂的解毒；抑制细胞过度增殖；诱导细胞凋亡；调节免疫功能；影响细胞信号传导途径等。
                               
   茶黄素是茶多酚物质氧化形成的一类能溶于乙酸乙酯、含有多个羟或酚羟基的苯骈卓酚酮化合物，是茶色素的主要成分，共有12种组分，其中茶黄素（TF）、茶黄素-3-没食子酸酯（TF2A）、茶黄素-3，3’-双没食子酸酯（TFDG）和茶黄素-3’-没食子酸酯（TF2B）是4种最主要的茶黄素。对于红茶色素的重要品质成分茶黄素，其主要活性物质的抗癌作用和机理取得了许多重要结果，并且对其抑制肿瘤产生的作用机理进行了大量研究，认为其作用的途径主要集中在癌前启动和促进二阶段。
一、茶黄素类可以在肿瘤起始阶段抑制其发生
（一）茶黄素类对肿瘤细胞的转录和生长因子的抑制
Apostolides Z研究表明茶黄素类可能通过抑制细胞色素P450 酶的作用，而将肿瘤遏制在起始阶段。TFs和儿茶素对2-氨基-1-甲基-6-苯丙咪唑[4,5-b吡啶] 诱导的突变进行抑制作用研究，结果表明，TFs及含有没食子酸酯的儿茶素都能抑制PhIP诱导突变（此途径经过细胞色素P450途径）。其机制是TFs能清除自由基、超氧阴离子等，并能切断脂质过氧化链式反应。
Nomura M和Chung J认为核转录因子激活蛋白-1 (activator protein 1，AP-1)是由基因c-jun(一种原癌基因)编码的蛋白，是细胞凋亡过程中重要的调节蛋白分子．也是肿瘤发生的重要因子，控制与信号传入有关的基因表达。
NF-kB是一种转录因子，存在于胞浆中，并被IKB结合抑制。IKB可以抑制NF-kB与其操纵基因结合。当IKB上Ser32、Ser36磷酸化后，IKB就与NF- kB脱离开，并经泛素途径分解从而激活NF- kB。具有活性的NF- kB就会启动iNOS基因转录并表达成iNOS合酶（诱导型NO合酶）。在乙酰辅酶Ⅱ等辅因子存在的条件下，这种酶能催化L-精氨酸生成NO。NO是引起炎症的重要因子，同时在肿瘤的各个阶段也发挥着重要作用，胞内高浓度的NO会导致基因毒性。Tasi等人研究发现，TFDG可抑制由脂多糖（LPS）激活的鼠巨噬细胞（RAW264.7细胞）中NO和iNOs的产生，TFDG比EGCG强，而其他多酚类没有这种作用。通过蛋白质印迹法和RT-PCR (逆转录聚合酶链式反应)分析证实了TFDG可以降低130-kD蛋白的产生，同时抑制iNOs的表达也受到抑制。同样EMSA分析也显示TFDG阻止NF-kB活性的降低。其机制是TFDG抑制了IkB中Ser32的磷酸化，并且减少转录因子NF-kB亚结构P65和P50的积累从而阻断肿瘤的发生。
茶黄素类可以通过抑制AP-l作用和促分裂原活化蛋白激酶的途径起到抑制癌细胞生长的作用。Nomura M 等通过电泳法、蛋白质印迹法分别分析AP-1的活性和c-jun基因表达，结果表明，TF-3不仅强烈抑制TPA诱导的AP-1活性，同时也是c-jun基因表达的强烈抑制剂，其机制是抑制c-iun蛋白Ser73位点的磷酸化。这说明茶黄素类可以在起始阶段抑制肿瘤的生长。
Liang等发现，TPA（诱变剂）能提高膜结构上PKC激酶的活性，而TFDG可强烈抑制PKC活性的升高，抑制率为94.5％，EGCG的抑制率只有9.4％。TFDG不仅强烈抑制TPA诱导的AP-1活性，同时也是c-jun基因表达的强烈抑制剂，其机制是抑制c-jun蛋白Ser73位点的磷酸化。
在TFs的抑制作用中，H2O2不能发挥重要作用。Chung等在体外利用小鼠表皮J86细胞层和一个突变形H-ras基因构建模拟的癌细胞，并研究TFs对这些细胞的作用。结果表明：TFs表现出对30.76ras红细胞生长的抑制及对AP-1作用的抑制。C环上的没食子酰基可以促进TFs对细胞生长及AP-1作用的抑制。在已加入TFs的细胞中加入过氧化氢酶，不能阻止TFs对AP-1作用的抑制。
TFs还可以通过抑制生长因子受体阻断肿瘤的启动。Liang 与Yuchih等研究茶黄素和茶红素对A431细胞和鼠NIH3T3纤维母细胞胞外信号和增殖的抑制，结果发现，在茶多酚预培养的细胞中，TFDG能抑制由EGF(表皮生长因子)和PDGF（血小板源性生长因子）诱导的EGF受体和PDGF受体自动磷酸化，并且强烈抑制EGF与其受体结合，从而阻断与游丝分裂相关基因的信号传导，其作用比EGCG更强。另外上述试验物分别与EGF同时加入培养液中，结果发现仅TFDG起作用。
（二） 茶黄素类清除自由基抑制细胞的突变
1．茶黄素的抗氧化机制
（1）抑制自由基产生。生物体内自由基的生成具有多种途径，其中主要有3种：①分子氧的单电子还原途径，氧接受一个电子生成O2·¯或再接受一个电子生成H2O2，H2O2失去一个电子生成·OH或再失去一个电子生成H2O。这一过程主要产生O2·¯，正常情况下，生物体约有2％的总耗氧量经呼吸链旁路（单电子还原过程）生成氧自由基；②酶促催化产生自由基：机体细胞液中含有一些可溶性酶，如黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、脂氧合酶等，是常见的可产生自由基的酶；③某些生物物质的自动氧化：过氧化物及某些金属离子的氧化还原均可使机体产生自由基，其中Fe2+催化H2O2产生·OH（Fenton反应）和过渡金属离子催化LOOH均裂产生脂氧自由基最为常见。茶黄素可通过抑制氧化酶系与络合诱导氧化的金属离子途径达到抑制自由基产生的作用。
（2）抑制氧化酶系。缺血与再灌注、吞噬细胞激活、花生四烯酸代谢异常及补体激活是产生活性氧的重要途径。其来源主要由两大细胞系统及多套酶系统。花生四烯酸的三条代谢途径均伴有活性氧的产生，内皮细胞主要依靠黄嘌呤氧化酶系统(XO)、中性粒细胞主要依靠髓过氧化酶系统(MPO)及还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化形成氧化型辅酶Ⅱ(NADP)产生活性氧，脂氧化酶和环氧化酶、NO合成酶等生物体内许多氧化酶与自由基生成相关。相关研究报道表明，茶黄素对上述大部分氧化酶均有抑制作用（表1）。
表 1茶黄素对氧化酶的抑制作用
氧化酶系自由基产生机制茶黄素的活性
黄嘌呤氧化酶
（XO）XO催化次黄嘌呤转变为黄嘌呤，进而催化黄嘌呤转变为尿酸。反应过程中产生大量的O2·¯与H2O2 (其在金属离子参与下形成羟自由基)。
 在HL－60细胞中，抑制XO产生尿酸并清除过氧化物，且TF3抑制能力均强于TF1、TF2、EGCG。
对H2O2清除能力依次为TF2>TF3>TF1>EGCG。
细胞色素P450 1A1（CYP1A1）
主要参与代谢活化多环芳烃类（PHAs）化学致癌物的I 相酶，具有芳香烃羟化酶（AHH）活性
 PHAs在体内活化过程主要由CYP1A1催化完成，在过程同时产生对身体有害的自由基在HepG2细胞中，抑制由奥美拉唑(OPZ)诱导的CYP1A1的活性。
还原型辅酶Ⅱ（NADPH）NADPH氧化形成氧化型辅酶Ⅱ（NADP）产生活性氧可抑制NADPH的两个亚单位p22phox和p67phox, 同时上调过氧化氢酶的活性（p<0.05）, 从而减少活性氧的产生。
 
诱导型一氧化氮合成酶
（iNOS）当一氧化氮（NO）过量，影响细胞内部信号传导，从而诱发基因突变、细胞凋亡或肿瘤的发生。还会使血管内皮细胞产生过氧化，促进 LDL 与泡沫巨噬细胞的作用，进而提高动脉硬化和梗塞的机率。在活化的鼠类的腹膜巨噬细胞中，茶黄素能够抑制 NO 的产生。逆转录聚合酶链反应
（RT-PCR）显示，茶黄素对iNOS有负调节作用。
脂肪氧合酶花生四烯酸因脂肪氧合酶的酶促氧化，可产生大量的活性氧及其代谢产物，对机体产生损伤与致癌作用。TF2与TF3可有效抑制脂肪氧合酶的活性， 且均强于儿茶素。此外，茶黄素可通过抑制氧化酶的合成途径达到抑制氧化酶的作用。Lin, Y. L.等研究表明，TF3对诱导型的一氧化氮合成酶(iNOS)的抑制作用是通过对抑制iNOS mRNA 的表达来实现的。由于核因子kappaB是诱导iNOS所必须的转录因子，TF3通过阻断核因子kappaB的活化，来抑制iNOS的表达。此外，TF3还可以抑制核因子 kappaB的 p65 与p50 亚基的磷酸化，抑制IkappaB激酶(IKK)，从这两个途径来最终达到抑制iNOS合成的目的。
（3）茶黄素与诱导氧化的过渡金属离子络合
机体内过渡金属离子是自由基的另一重要来源。过渡金属离子绝大多数均含有未配对电子，都是自由基，它们可以催化自由基的形成。体外实验证明，40μmol/L的茶黄素磷酸盐与终浓度为40μmol/L铜、铁离子的硫酸盐络合以后，形成的复合物在可见光区出现了新的吸收峰。当培养基中无金属离子存在时,巨噬细胞中LDL氧化程度很小，当加入少量FeSO4后,可以有效提高LDL的氧化程度，这表明存在一定金属离子时会促使LDL的氧化。茶黄素类物质与金属离子络合可以直接降低LDL的氧化程度，也可抑制机体内Fenton反应, 起到抑制活性氧自由基产生的作用。同时茶黄素类对机体内金属离子释放也具有抑制作用，在400μmol/L以下,TF3可以降低培养基中金属离子的浓度, 但只有大于400μmol/L时, 效果才达到显著水平。
（4）直接清除自由基。茶黄素通过抑制自由基的产生途径而减少自由基，对于机体内固有的自由基，茶黄素则有直接清除作用。体外实验表明茶黄素能有效清除2, 2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)(ABTS)自由基，且抗氧化能力的强弱次序为TF3>TF2A=TF2B>TF1。在 HL-60细胞模型中，用四豆蔻的佛波醇醋酸酯(TPA)诱导自由基的产生，在该模型中观察到茶黄素能抑制约 60%的自由基的形成。
茶黄素除了作为预防性抗氧化剂清除自由基外，可作为链阻断式抗氧化剂清除脂自由基。脂质在活性氧或辐射条件下产生自由基，引发脂质自由基链式反应。茶黄素可与脂质链式氧化中间产物－脂自由基或脂氧自由基反应，终止链反应而抑制脂质氧化。在鼠巨噬细胞或人内表皮细胞中，TF3能减少细胞低密度脂蛋白(LDL)的氧化,抑制能力强弱依次为TF3>TF1>EGCG>EGC>GA。TF1、TF3与茶红素均能有效抑制叔丁基过氧化氢诱导鼠肝匀浆脂质过氧化，且能力均强于抗坏血酸、谷胱甘肽(GSH)、BHT和BHA]。在体外实验中，通过检测LDL氧化过程中形成的硫代巴比妥酸的反应底物和共轭双烯，抑制LDL氧化的活性强弱依次为TF3>ECG>EGCG>TF2>TF1>EC> EGC。从LDL氧化过程中共轭双烯的形成时间的快慢程度看，茶黄素以及儿茶素等能延缓共轭双烯形成，这一作用的强弱顺序为EGCG>茶黄素>α-维生素E。
（5）对抗氧化体系的激活作用。茶黄素除了直接清除自由基或抑制自由基产生外，还能通过激活机体自身的自由基清除机制而增强抗氧化效果。正常情况下，机体自由基维持在损伤阈值以下的平衡态，而这种平衡态的维持依赖于机体的抗氧化体系，包括非酶体系和酶体系。生物体抗氧化酶主要有超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽酶类(包括GSH-Px，GSSG-Tr)和过氧化氢酶(CAT)。抗氧化酶的重要生理功能在于其对自由基的清除作用。茶黄素能有效促进这些抗氧化酶的活性（见《茶叶世界》2007年第21期)。
（6）茶黄素的抗氧化构效关系。茶黄素的强抗氧化活性赋予其独特的生理功能，使其应用前景广阔。结构决定性质，茶黄素的卓越的功效源于其独特的结构。茶黄素的结构中，除了保持了其前体儿茶素 A 环上的两个酚羟基外，由两个B环形成的苯骈卓酚酮环结构，也具有3个羟基。还有没食子酸酯所带的酚羟基，这些羟基保证了它具有很强的提供质子的能力。
茶黄素的前体物质－儿茶素的A环与B环一般情况下比较稳定，不易发生裂环反应，而在活性氧的作用下，可发生剧烈的反应，产生双黄烷醇类物质和羧酸类物质。以往的研究认为儿茶素清除自由基的作用仅与其结构B环相关，最近的研究报道证实 A环与B环均是儿茶素的抗氧化活性的主要位置，且没食子酰基并未参与整个反应中。儿茶素在不同活性氧的作用下，会形成不同的反应产物，且反应的活性位置也不同。不同儿茶素在同一活性氧作用下，反应的活性位置也可能不同。这也表明了儿茶素的抗氧化活性位置不仅取决于活性氧的种类，也会受儿茶素本身的结构影响。在DPPH反应体系中，利用NMR技术研究儿茶素结构对其捕获电子的能力影响结果表明，邻苯三酚型(焦酚型)儿茶素强于邻苯二酚型(儿茶酚型)儿茶素；含有共轭羰基的结构会降低儿茶素的抗氧化能力；含有共轭烯双键结构会降低邻苯三酚型儿茶素的抗氧化能力，却能提高邻苯二酚型儿茶素的能力。
二、茶黄素类抗肿瘤转移
TFs可以促进各种细胞的凋亡，抑制癌细胞的增殖和扩散。Hibasami H等发现茶黄素类可以抑制胃癌细胞KATO的生长并诱导凋亡。通过形态学变化观察可以看到细胞凋亡体。检测凋亡DNA条带的结果表明：细胞凋亡与茶黄素类的剂量、时间等成依存关系。Zhang G Y等人的研究结果表明：绿茶、乌龙茶及红茶提取液可以抑制大鼠腹水肝癌AH109A细胞层的增殖和扩散，但对正常的大鼠M­细胞（mesothelia cells, 内皮细胞）无影响。高浓度的红茶、乌龙茶提取液还可以抑制L929癌细胞的增殖。在加入10％小牛血清时，AH109A细胞可以扩散到M-细胞单细胞层的底部。当利用口腔插管法饲喂茶提取液0.5、1、2、3、5h后，再加入小牛血清，则AH109A细胞的扩散和增殖均得到抑制。茶黄素是红茶提取液中抑制癌细胞AH109A增殖和扩散最有效的成分，而其作用也与细胞本身的特异性和细胞对茶黄素类作用的高灵敏性有关。根据Marimaeda-Yamamoto等人的研究，TF可以抑制人体纤维肉瘤HT1080细胞的扩散，并与剂量呈依存关系。
MMPs(金属巯蛋白)是以锌为活性中心的蛋白质酶谱，在癌细胞的转移中具有促进作用，其中MMP-2和MMP-9在癌细胞扩散和转移中具有重要作用。茶黄素可以与锌结合，从而抑制MMPs酶的活力，达到抑制癌细胞扩散的目的。根据Mari的研究TF可以抑制HT1080细胞分泌MMPs，但其浓度范围与抑制HT1080细胞扩散的浓度范围不同。Suzuka M等的研究也表明：TF、TF2A、TF2B和TFDG可以抑制鼠肺细胞的扩散。酶谱结果显示：癌细胞分泌的MMPs中主要包括MMP-2和MMP-9。茶黄素类可以通过抑制MMP-2和MMP-9的分泌来抑制肿瘤细胞的扩散。
据Lu Jiebo报道，在比较4种主要TFs对正常细胞和癌细胞的生长、凋亡、基因表达的作用时发现,TF(10～50μmo1)能抑制突变体细胞WI38VA(WI38突变体)和Caco-2结肠癌细胞的生长，能在mRNA和蛋白质水平上抑制血清诱导的Cox-2基因的表达，从而诱导细胞凋亡，但对相应的正常细胞没有影响。Giovanna Cademi等在研究红茶、绿茶提取物及红葡萄酒对AOM诱导的小鼠(16周后)肠道肿瘤时发现，在喂食红茶提取物和葡萄酒的试验组中，患腺瘤的小鼠(雄F344鼠)数量明显低于对照组(对照组、红茶、绿茶提取物及红葡萄酒试验组中患腺瘤的小鼠分别为86％、59％、90％和50％)，而红茶组在诱导肿瘤细胞凋亡上又明显优于其他组。形态学观察发现，细胞发生收缩，与相邻细胞失去联系且铬氨盐浓度升高，形成圆形或椭圆形的核碎片，从而诱导细胞凋亡。中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所在研究茶色素(包括茶黄素、茶红素、茶褐素)抗肿瘤作用的实验中发现，茶色素10～l00μg/mL对Hela细胞存活的抑制率为2.2％～34．1％ ，对S180在小鼠体内的增殖有明显抑制作用，并有较明显的量效关系，表明对肿瘤细胞的增殖阶段有抑制作用。Yang发现TFs可抑制NNK诱导的A／J鼠的肺癌。Morse MA等研究TFs和EGCG对N-硝基化甲基苯甲胺(NMBA)诱导鼠食道癌的影响时发现，TFs和EGCG浓度在360～1200mg/L可明显减少其食道癌的形成。
屠幼英等研究了EGCG、TFDG、茶黄素TF、葡萄籽提取物、松树皮提取物、咖啡碱、槲寄生和茶氨酸的体外抗癌活性，通过人肺癌细胞（A549）进行体外试验，结果表明除咖啡碱、槲寄生、茶氨酸的作用较小以外，其他几种均有很强的诱导人肺癌细胞（A549）凋亡的作用。
屠幼英等用TFDG、TF2B及一种未知化合物。采用MTT法和磺酰罗丹明B法研究3种单体和TFS对人胃癌细胞（MKN-28）、人肝癌细胞（BEL-7402）和人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)的生长抑制，结果表明，TF2B和未知物的浓度与相应的MKN-28、BEL-7402抑制效果相关性达到极显著水平，前者对三株癌细胞均显示了一定的抑制活性；3种单体对前两种癌细胞的抑制效果均高于TFS。
因此，茶黄素是一种具有特出抑制癌细胞生长的天然生物活性物质。并且根据杨子银和屠幼英等分析，茶黄素也是非常有前途的替代合成抗生素的植物类抗生素物质。