慈溪3分17 百度云:HPV DNA 基因分型检测方法综述[1]

HPV DNA 基因分型检测方法综述[1] 一、概述 （一）宫颈癌研究现状 ?宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病的位置位于子宫的开口部位——子宫颈的内壁，发病率在女性恶性肿瘤中居第二位，仅次于乳腺癌。据世界范围内统计，每年大约有46.6 万左右的宫颈癌新发病例，占所有癌症新发病例的 5％，其中 80％的病例发生在发展中国家。所以，提早预防、诊断和治疗子宫 颈癌就成为了维护妇女健康的首要问题。 （二）宫颈癌与 HPV 病毒的关联 人乳头状瘤病毒（HPV）与宫颈癌关系密切，宫颈癌是妇女第二大致死癌病，临床证明95％～99.7％的宫颈癌病例和高危型 HPV 病毒感染有关。自 1977 年 Laverty 在电镜中观察到宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒（HPV）颗粒，以及 Zur Hausen 提出 HPV 病毒与宫颈癌发病相关联的假设后，国内外学者对此问题进行了大量的研究， 最终在1995年的 IARC 专题讨论会上通过 HPV 感染是宫颈癌的主要原因，即 HPV 感染是宫颈癌发生的先决必要引发条件。HPV 可分为高危型和低危型两种，长期持续感染高危型可以致癌，危害生命。低危型 HPV 可导致生殖器尖锐湿疣，影响生活质量。同时，有一定比例的低危型感染还伴有高危型混合感染。因此，临床尖锐湿疣患者进行高危及低危 HPV 病毒检测非常重要。高危型 HPV 导致癌病的机会较高，科学研究发现至少有 20 种高危型 HPV 与 95％的早期浸润和浸润性子宫 颈癌有关。HPV 感染，特别是高危型 HPV 感染，与宫颈癌的发生存在明确关系。从近期在欧洲(表 1) 及其它各地的人群随意 HPV 筛选结果证实，HPV 可以在 99.8％的宫颈癌患者中发现。 表 1 近期欧洲 HPV 筛选结论 筛选人数 >44000 宫颈涂片细胞检测结果 正常 BMD CIN I CIN II CIN III 癌肿瘤 入侵性癌瘤 人群(％) 96.6 2.5 0.8 0.4 0.3 0.1 <0.1 hr-hpv 高危型 3.6 34.6 88.3 82.9 93.5 95.2 100 （三）进行 hpv 病毒检测诊断的意义 hpv 感染通常是没有症状的，在大多数国家，hpv 感染非常常见。据世卫组织研究统计，曾感染 hpv 的人数，在性活跃期男女中的比率为 50％，到 50 岁该数字增加到 80％，所以它是世界上第一大传染疾病。全世界每年有约 10％～15％的新发病例。虽然大部分妇女 hpv 感染期比较短，一般在 8～10 个月左右，但仍有大约 10％～15％的 35 岁以上的妇女有持续感染的情况。这些持续感染 hpv 的妇女， 患子宫颈癌的风险更高。过去，因缺少高灵敏度和特异性的 hpv 诊断试剂，大约 70％的感染者在最初的两年是无法检测到 hpv 的。大部分感染了 hpv 的妇女将会发展为轻度宫颈损伤，而大多数轻度损伤都是可以自动恢复的。有研究表明约有15％的 hpv 感染者将会在两年内发展为重度损伤，而重度宫颈损伤极有可能发展为恶性癌变，有统计认为大约 1/3 的重度宫颈损伤将在 10 年内(而最近在很多案例中发现转癌速度可以短至 3 年内)发展为癌症。在诊断及防治这方面仍然缺乏有效的措施。对 hpv 病毒感染进行准确的检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性，同时改善妇女宫颈癌的防治。 宫颈癌早期症状不明显，筛查预警对早期发现宫颈癌，降低死亡率极为重要。传统上，宫颈涂片检测是 群体筛查的常规手段，属于细胞学检测方法。实验室的技术人员会于显微镜下观察不正常的细胞以诊断 病人的病情，但由于这方法只以观察作为诊断基础，受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，其准确率 低，假阴性高，重复性差，得到的结果及分析漏诊率可达30％。在检查和筛选 ?hpv 的基因型方法中，实时荧光 pcr 法及杂交捕获法是最为常用的，但是实时荧光 pcr 法所需要的设备比较昂贵，而且其于不同种基因型 hpv 的诊断操作繁琐，不适合于对子宫颈癌的大规模筛查。商业化的杂交捕获法试剂盒 无须 pcr 扩增即可检测出临床样品中的 hpv dna，并且可区别高危型和低危型两类，但是此类试剂盒 无法鉴定出感染 hpv 的具体基因型。最近的分型与临床的结合研究已经证实不同的 hpv 亚型在致癌性方面存在比较大的差别 ?(图 1)，这些数据用于诊断结合临床治疗至为重要，因此有必要对各个宫颈样本 中存在的 hpv 进行分型检测，从而有助于更详细的分析各种 hpv 的致病性，以达到最佳的临床疗效。 图一 hpv不同分型的感染与宫颈癌的关系 二、hpv 检测诊断方法的现状 hpv 不能在体外培养，所以对它的检测严格依赖于其 dna 序列分子水平的检查， 目前对 hpv 的检测诊断方法主要有以下几种： （一）子宫颈细胞抹片及 elisa 法 子宫颈细胞抹片检查是传统的 hpv 检测方法，假阴性率高达 20％～30％。其原因可能是因为筛查失 误，如筛检者没有辨认出抹片的异常细胞，也可能是异常细胞没有脱落，所以采样无效。elisa 方法是 另一种传统检测方法，因制备相应型的单抗工作繁琐，到目前为止，此方法只能用于个别亚型的鉴定，如宫颈癌相关的高危性 hpv16 , 18 或低危型 6 ,11。目前已经被逐渐取代。 （二）杂交捕获检测法 美国 digene 公司的 hc-ii 杂交捕获法检测方法,可以检测高、低危群体的 hpv 病毒，但这种分类试剂盒，有很大的局限性： 1．在分型与临床的结合研究中，已经证实不同的 hpv 亚型在致癌性方面存在很大的差别 (图 1)。 所以无论在预防筛查、早期诊断，以至病人的分流（triage）、治疗的角度看，对 hpv 尤其是高危型 hpv 进行检验和分型极为重要。 2．虽然在临床测试中，现用的 hc-ii 试剂盒对宫颈上皮内瘤样病变(cin) 及宫颈癌 hpv 诊断，有良好 的 吻 合 率。在 轻 微 或 病 变 前 (bmd) 的诊 断其 灵 敏度 ( 89 ％ ～ 97 ％ )虽然 也 不 错 ， 但 假 阳 性率 高 (50％～60％)、特异性低(37％～64％)，在这两个指标方面均不够理想如要提高特异性，就必须提高检定 下限值(cutoff rlu) ，但这样假阴性率就必然高，不能达到筛查的目的，对癌前病变者的影响就更为严 重。临床证实，巴氏涂片正常而受高危 hpv 病毒感染者，在其后的跟踪检验中，癌变的机率高出 3～5.7 倍。提高检测下限值，这些病例便可能成为假阴性。hpv 检测不但用于初查、ascus 的跟进，也用于手 术治疗前后的检测，增进疗效，灵敏度降低便不能达到目的。 3．hpv 诊断，在美国已被列入宫颈癌的医疗预检测试手册中，全民可用。可是超过 80％的病例却 发生在较贫穷的第三世界，包括中国在内的第三世界国家无法承受该昂贵的试剂盒。因此必须研发出准确、 快速、价廉的 hpv 检测技术。 4．其试剂盒的研发大多数是基于美国的资料，未必完全适合于中国以至第三世界国家使用。 （三）pcr 检测法 与传统的细胞抹片检查相比，pcr 检测灵敏度高，可检测极微量的 hpv dna。但是由于涉及到多 hr-hpv="" 高危型="" 3.6="" 34.6="" 88.3="" 82.9="" 93.5="" 95.2="" 100="" （三）进行="" hpv="" 病毒检测诊断的意义="" hpv="" 感染通常是没有症状的，在大多数国家，hpv="" 感染非常常见。据世卫组织研究统计，曾感染="" hpv="" 的人数，在性活跃期男女中的比率为="" 50％，到="" 50="" 岁该数字增加到="" 80％，所以它是世界上第一大传染疾病。全世界每年有约="" 10％～15％的新发病例。虽然大部分妇女="" hpv="" 感染期比较短，一般在="" 8～10="" 个月左右，但仍有大约="" 10％～15％的="" 35="" 岁以上的妇女有持续感染的情况。这些持续感染="" hpv="" 的妇女，="" 患子宫颈癌的风险更高。过去，因缺少高灵敏度和特异性的="" hpv="" 诊断试剂，大约="" 70％的感染者在最初的两年是无法检测到="" hpv="" 的。大部分感染了="" hpv="" 的妇女将会发展为轻度宫颈损伤，而大多数轻度损伤都是可以自动恢复的。有研究表明约有15％的="" hpv="" 感染者将会在两年内发展为重度损伤，而重度宫颈损伤极有可能发展为恶性癌变，有统计认为大约="" 1/3="" 的重度宫颈损伤将在="" 10="" 年内(而最近在很多案例中发现转癌速度可以短至="" 3="" 年内)发展为癌症。在诊断及防治这方面仍然缺乏有效的措施。对="" hpv="" 病毒感染进行准确的检测可提高宫颈癌前病变筛查的敏感性，同时改善妇女宫颈癌的防治。="" 宫颈癌早期症状不明显，筛查预警对早期发现宫颈癌，降低死亡率极为重要。传统上，宫颈涂片检测是="" 群体筛查的常规手段，属于细胞学检测方法。实验室的技术人员会于显微镜下观察不正常的细胞以诊断="" 病人的病情，但由于这方法只以观察作为诊断基础，受取材、涂片制作质量、阅片技术影响，其准确率="" 低，假阴性高，重复性差，得到的结果及分析漏诊率可达30％。在检查和筛选="" pv="" 的基因型方法中，实时荧光="" pcr="" 法及杂交捕获法是最为常用的，但是实时荧光="" pcr="" 法所需要的设备比较昂贵，而且其于不同种基因型="" hpv="" 的诊断操作繁琐，不适合于对子宫颈癌的大规模筛查。商业化的杂交捕获法试剂盒="" 无须="" pcr="" 扩增即可检测出临床样品中的="" hpv="" dna，并且可区别高危型和低危型两类，但是此类试剂盒="" 无法鉴定出感染="" hpv="" 的具体基因型。最近的分型与临床的结合研究已经证实不同的="" hpv="" 亚型在致癌性方面存在比较大的差别="" 图="" 1)，这些数据用于诊断结合临床治疗至为重要，因此有必要对各个宫颈样本="" 中存在的="" hpv="" 进行分型检测，从而有助于更详细的分析各种="" hpv="" 的致病性，以达到最佳的临床疗效。="" 图一="" hpv不同分型的感染与宫颈癌的关系="" 二、hpv="" 检测诊断方法的现状="" hpv="" 不能在体外培养，所以对它的检测严格依赖于其="" dna="" 序列分子水平的检查，="" 目前对="" hpv="" 的检测诊断方法主要有以下几种：="" （一）子宫颈细胞抹片及="" elisa="" 法="" 子宫颈细胞抹片检查是传统的="" hpv="" 检测方法，假阴性率高达="" 20％～30％。其原因可能是因为筛查失="" 误，如筛检者没有辨认出抹片的异常细胞，也可能是异常细胞没有脱落，所以采样无效。elisa="" 方法是="" 另一种传统检测方法，因制备相应型的单抗工作繁琐，到目前为止，此方法只能用于个别亚型的鉴定，如宫颈癌相关的高危性="" hpv16="" ,="" 18="" 或低危型="" 6="" ,11。目前已经被逐渐取代。="" （二）杂交捕获检测法="" 美国="" digene="" 公司的="" hc-ii="" 杂交捕获法检测方法,可以检测高、低危群体的="" hpv="" 病毒，但这种分类试剂盒，有很大的局限性：="" 1．在分型与临床的结合研究中，已经证实不同的="" hpv="" 亚型在致癌性方面存在很大的差别="" (图="" 1)。="" 所以无论在预防筛查、早期诊断，以至病人的分流（triage）、治疗的角度看，对="" hpv="" 尤其是高危型="" hpv="" 进行检验和分型极为重要。="" 2．虽然在临床测试中，现用的="" hc-ii="" 试剂盒对宫颈上皮内瘤样病变(cin)="" 及宫颈癌="" hpv="" 诊断，有良好="" 的="" 吻="" 合="" 率。在="" 轻="" 微="" 或="" 病="" 变="" 前="" (bmd)="" 的诊="" 断其="" 灵="" 敏度="" (="" 89="" ％="" ～="" 97="" ％="" )虽然="" 也="" 不="" 错="" ，="" 但="" 假="" 阳="" 性率="" 高="" (50％～60％)、特异性低(37％～64％)，在这两个指标方面均不够理想如要提高特异性，就必须提高检定="" 下限值(cutoff="" rlu)="" ，但这样假阴性率就必然高，不能达到筛查的目的，对癌前病变者的影响就更为严="" 重。临床证实，巴氏涂片正常而受高危="" hpv="" 病毒感染者，在其后的跟踪检验中，癌变的机率高出="" 3～5.7="" 倍。提高检测下限值，这些病例便可能成为假阴性。hpv="" 检测不但用于初查、ascus="" 的跟进，也用于手="" 术治疗前后的检测，增进疗效，灵敏度降低便不能达到目的。="" 3．hpv="" 诊断，在美国已被列入宫颈癌的医疗预检测试手册中，全民可用。可是超过="" 80％的病例却="" 发生在较贫穷的第三世界，包括中国在内的第三世界国家无法承受该昂贵的试剂盒。因此必须研发出准确、="" 快速、价廉的="" hpv="" 检测技术。="" 4．其试剂盒的研发大多数是基于美国的资料，未必完全适合于中国以至第三世界国家使用。="" （三）pcr="" 检测法="" 与传统的细胞抹片检查相比，pcr="" 检测灵敏度高，可检测极微量的="" hpv="">