农家乐小爸爸番外:核酸的纯化、浓缩2 - 食品课堂 - 食品伙伴个性空间 食品伙伴个性空间 - Powere...

在微型离心管中乙醇沉淀的标准方法
(1)估计DNA溶液的体积。
(2)调整单价阳离子的浓度。若DNA溶液中含有高浓度的盐，可用TE(pH8.0)稀释，否则加入表A8-1列出的一种盐。
如果DNA溶液的体积不超过400ul可在单个微型离心管中进行沉淀，体积较大时可分成数管，或者在适宜于中速离心或超离心的离心管中进行离心。
(3)充分混匀溶液，准确加入2倍体积的冰冷乙醇，再充分混匀溶液。将此含乙醇的溶   液置冰上使DNA沉淀形成。
一般放置15-30min就足够了。但如果DNA分子太小(小于100个核苷酸)或者DNA的含量太低(低于0.1ug/ml)则需把在冰上放置的时间延长到1h以上并加入MgCl2至终浓度0.01mol/L。DNA可在含乙醇的溶液中于0℃或-20℃无限期地保存。
(4)于0℃离心回收DNA。
在多数情况下于最大转速离心10min就足够了。然而如以上所述，在沉淀低浓度DNA(低于20ng/ml)或非常小的片段时则需要延长离心的时间。
手持打开盖子的微型离心管成一定角度，使沉淀物在上侧，将一个一次性吸头连至真空管道，从管内抽吸液体。把吸头置于离心管下侧，恰好在液体的凹面以下。随着液体的吸出，可将吸头移向管底。抽吸要温和，以免沉淀吸入吸头，并应使吸头的尖部离开沉淀。最后吸尽附着于管壁的液滴。
(5)用自动微量移液器或连于真空管道的一次性吸头(见图A8-2)小心移出上清液，注 意不要扰动沉淀(有时沉淀是看不见的)。用吸头吸尽附于管壁的所有液滴。在沉淀比较珍贵的DNA样品时，最好暂时留存上清液，直至确定已回收到沉淀的DNA后再废弃。
(6)加半管70%乙醇，于4℃以最高转速离心2min。
(7)重复第5步。
(8)将离心管于室温下敞口放置在实验台上，直至残留的液体挥干。过去常用冻干机干燥沉淀，这一步不仅没有必要，而且也不适当，因为这样会引起小片段DNA(小于    400个核苷酸)的变性(Svaren et al，1987)，还大大降低大片段DNA的收率。
(9)将DNA沉淀(沉淀常常是看不见的)重新溶解于适当体积的缓冲液(一般为pH    7.6-8.0的TE)，用缓冲液充分漂洗管壁。
[注]i在微型离心管中离心之后，并非所有DNA沉淀都沉积在管底，沉积在管壁的DNA最多可达50%。为了回收到所有DNA，应使液滴在管壁的适当部位来回滚动，可用微量加液器上的一次性吸头推动液滴。
ii可用1倍体积的异丙醇代替2倍体积的乙醇沉淀DNA。异丙醇沉淀的优点是离心液体的体积较小，但异丙醇挥发性较乙醇差而难于去除，另外有些溶质如蔗糖和氯化钠等在用异丙醇时更容易共沉淀。总之，除非必须降低液体的体积，一般最好用乙醇沉淀。
iii一般用乙醇从溶液中沉淀出来的DNA重溶于低离子强度的缓冲液如TE(pH8.0)中比较容易，偶尔在用含MgCl2或浓度高于0.1mol/L Nacl的缓冲液直接溶解DNA沉淀时可能要遇到一点困难。因此最好是先用少量低离子强度的缓冲液将DNA溶解后再调节缓冲液的成分。若样品不易溶于较小体积的缓冲液，可用多一些缓冲液溶解，再重新用乙醇沉淀。第二次沉淀有助于去除多余的盐及可能妨碍DNA溶解的其他成分。
用乙醇沉淀RNA
RNA可以用含2.5-3.0倍体积的乙醇从含有0.8mol/L LiCl、5mol/L醋酸铵或0.3mol/L醋酸钠的溶液中有效地沉淀下来。选择上述哪一种盐要取决于其后RNA的用途。由于十二烷基硫酸钾盐的极难溶，若要将沉淀得到的RNA溶于含SDS的缓冲液(如用寡聚dT-纤维素层析时就使用这种缓冲液)则应避免使用醋酸钾。同样，如果RNA已溶于含有SDS的缓冲液中，沉淀时也不要用醋酸钾。
[注]用于沉淀RNA的溶液应是无RNA酶的(见第7章)。
用氯化锂沉淀大分子RNA
小分子RNA(如tRNA和5SrRNA)在离子强度高的溶液中可溶，而大分子RNA(如rRNA和mRNA)则不溶，可通过离心沉淀下来。
(1)测量样品的体积，加0.2倍体积无RNA酶的8mol/L LiCl，充分混匀，置冰浴中至少2h。
(2)于0℃以15000g离心20min，弃上清，将沉淀下来的大分子RNA重溶于0.2倍体积水中。
(3)重复1和2步。
(4)用2倍体积乙醇沉淀，从重悬的沉淀物中回收大分子RNA。
用微量浓缩器进行核酸的浓缩及脱盐
除乙醇沉淀外，超滤也是核酸溶液浓缩和脱盐的一种可供选择的方法。这种方法不需要相的变化，在处理低浓度核酸时特别有用。Millipore公司供有一种称为Microcon滤筒的离心超滤装置，可以有效地进行核酸的脱盐和浓缩。下述方案及加注采自Millipore公司的网站(WWW.millipore.com)，详细说明可从该网站上查找。
(1)选择一种型号的Microcon，其核苷酸截留值等于或小于待分离核酸的大小(见表    A8-3)。
(2)从提供的两只小管中取出一只，将Microcon滤筒插入其中。
(3)浓缩时(不影响盐的浓度)，可移取最多达500ul的样品(DNA或RNA)加到样品 池中，按说明书推荐的时间离心，转速不要超过表A8-3列出的离心力。
(4)若进行盐的交换，加适量适当的稀释液，使浓缩样品的体积至500ul。按说明书推   荐的时间离心，转速不要超过表A8-3列出的离心力。欲使盐的浓度更低，必要时可重复整个步骤。见表A8-3的脚注。
重要：样品池不要加得太满。
(5)从小管上取下样品池，倒置插入另一只小管中(在分析样品之前要留存滤液)。
(6)在一只微型离心管中于500—1000g离心2min回收小管中的核酸。
(7)取下样品池，盖紧管盖保藏样品。
表A8-3 微型浓缩gSMic忱on的核苷酸截留值
Microcon型号
颜色标志
核苷酸截留值*
建议最大离心力(xg)
离心时间/min
SS
DS
4℃
25℃
3
黄
10
10
14000
185
95
10
绿
30
20
14000
50
35
30
透明
60
50
14000
15
8
50
玫瑰红
125
100
14000
10
6
100
蓝
300
125
500
25
15
注：注意单纯超滤是不会改变缓冲液组成的。在Micrpcon中离心浓缩样品的盐浓度与原始样品的盐浓度相同。
脱盐时可在浓缩的样品中加水或缓冲液至原先体积，再重新离心(称作不连续渗滤)。这种脱盐的方式与超滤的浓缩系数有关。举例来说，一份含100mmol/L盐的500ul样品浓缩至25ul时(浓缩系数为20)，则样品中95%的盐被去除，而样品中的盐浓度仍为100mmol/L。再将样品用水稀释至500ul时盐的浓度降至5mmol/ml，再将此稀释的样品浓缩至25弘1可去除原先总量的99%的盐，这时浓缩样品盐浓度为0.25mmol/L(译者注：原文有误，0.25mmol/L是再将此浓缩样品用水稀释至500ul后的浓度)。若欲脱盐更彻底一些，可再进行一次溶解和离心的循环，即可脱去原先99.9%的盐量。
*ss表示单链，ds表示双链。
用丁醇抽提法浓缩核酸
在用仲丁醇(异丁醇)或正丁醇抽提水溶液时，一些水分子会分配到有机相中，抽提数轮之后能够显著降低核酸溶液的体积。这个方法可降低稀核酸溶液的体积，以致容易通过乙醇沉淀加以回收。
(1)测量核酸溶液的体积，加等体积异丁醇，用旋涡混合器混匀。
加入过多异丁醇会除去溶液中的全部水分而导致核酸沉淀。如果发生这种情况，可在有机相中加水，直到重新出现水相(其中含有核酸)。
(2)在微型离心管中以最高转速室温离心20s，或用台式离心机1600g离心1min。用   自动微量移液器移出并弃掉上层(异丁醇层)。
(3)重复1和2步直至水相达到所需体积。
由于异丁醇抽提并不能除盐，水溶液中的盐浓度会随溶液体积减小而成比例地增高。可通过离心柱层析或乙醇沉淀将核酸转换到所需的缓冲液中。