第九章 基因表达调控

一、术语或名词

    1．螺旋—转角—螺旋(helix—turn—helix)结构(简称HTH)  DNA结合蛋白的一种结构形式，HTH的一端是由氨基酸形成的。螺旋次级结构，又称为识别螺旋，它与一个由3个氨基酸组成的“转角”相连接，“转角”的另一端与第二个螺旋相接，第二个螺旋通过疏水相互作用稳定第一螺旋。

    2．锌指(Zincfinger)  DNA结合蛋白的另一种结构形式，它是一种含锌离子的蛋白亚结构。其特点是通过锌离子把4个氨基酸连在一起，利用锌离子相连的由氨基酸以。螺旋形式形成的“指”在大沟中与DNA相互作用，在蛋白质与DNA的结合作用中蛋白质上至少存在两种这样的“指”。

    3．亮氨酸拉扣(1eucinezipper)  DNA结合蛋白中常见的另一种亚结构形式，这一亚结构由每隔7个氨基酸就有1个亮氨酸残基的侧链形成，这个结构有点像拉链，不同于螺旋—转角—螺旋和锌指，“亮氨酸拉扣”本身不与DNA作用，而是保持另外两个。螺旋在正确的位置与DNA结合。

    4．操纵子(operon)  原核生物细胞中，功能相关的基因组成操纵子结构，由操纵区同一个或几个结构基因联合起来，形成一个在结构上、功能上协同作用的整体，作为表达的协同单位，受同一调节基因和启动子的调控。

    5．负转录调控(negativetranscriptioncontr01)  调节基因的产物是阻遏蛋白(repressor)，起谢产物，抑制物)的存在使激活蛋白处于不活动状态。

    7．启动子(promoter)  基因起始区的DNA区段，RNA聚合酶结合到这一区段后才开始转录。

    8．弱化作用(attenuation)  弱化作用是细菌辅助阻遏作用的一种精细调控。这一调控作用通过操纵子的前导区内类似于终止子结构的一段DNA序列而实现，它编码一条末端含有多个色氨酸的多肽链——先导肽，被称为弱化子。当细胞内某种氨酰tRNA缺乏时，该弱化子不表现终止子功能；当细胞内某种氨酰tRNA足够时该弱化子表现终止功能，从而达到基因表达调控的目的，不过这种终止作用并不使正在转录中的mRNA全部都中途终止，而是仅有部分中途停止转录，所以称为弱化。

    9．分解代谢物阻遏(catabolite repression)  当培养基含有多种能源物质时，微生物首先利用更易于分解利用的能源物质，而首先被利用的这种物质的分解对利用其他能源性物质的酶的产生阻遏作用。由于葡萄糖是首先被发现具有这种阻遏效应的物质，因此又被称为葡萄糖效应(glucose effect)。

10．鸟苷四磷酸(ppGpp)和鸟苷五磷酸(pppGpp)  当细菌处于氨基酸饥饿的紧急状态时，导致出现空载tRNA，这种空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使ppGpp和pppGpp大量合成，从而会关闭许多基因，也会打开一些合成氨基酸的基因，以应付这种紧急情况。ppGpp和pppGpp不是只影响一个或几个操纵子，而是影响一大批，也不只是调控转录，而也是调控翻译，所以它们可称为超级调控因子。

    11．"σ因子(sigmafactor)  帮助RNA聚合酶核心酶识别基因起始区启动子的蛋白质，起始转录作用。σ因子自身并无催化活性，在转录之前与核心酶结合。

    12．热激应答(heatshockresponse)  生物体受热激诱导所进行的一种转录和翻译的调控。如大肠杆菌生长在较高的温度下(如42-50℃)，某些基因则迅速表达，诱导产生热激蛋白，这种现象称为大肠杆菌的热激应答。

    13．信号传导(signaltransductio n)  通过信号途径在细胞内或细胞间传递信息的过程。例如：细菌生活在不断变化的环境中，必须随时作出相应的反应和调节以求生存，外部信号并不是直接传递给调节蛋白，而是首先通过传感器(senor)检测到信号，然后以变化的形式传到调节部位，这一过程称为细菌的信号传导。

    14．二组分调节系统(two—componentregulatorysystems)  原核生物的信号传导系统，由能检测环境信号的位于细胞质膜上的传感激酶蛋白质和位于细胞质中的应答调节蛋白组成。

    15．趋化性(chemotaxis)  细菌对某些特殊的化学药物具有“趋向”或“逃离”的行为，它是生物的一种趋(向)性。

    16．接受甲基趋化性蛋白(methylaccepting chemotaxisproteins，简称MCPs)  又被称为受体—转导蛋白，它是一些细菌的感受蛋白，也是跨膜蛋白质之一，负责传递化学感受信号穿过细胞膜，并在趋化反应中被甲基化。

    17．核糖体结合位点(ribosomebindingsite，RBS)  起始密码子AUG上游30～40核苷酸的一段非译区，它是遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的核糖体结合序列。

    18．SD(Shine—Dalgarno)序列  原核mRNA先导序列中的一段，长度一般为5个核苷酸，富含C、A，在RBS中。功能是与核糖体16SrRNA的3，端互补配对，使核糖体结合到mRNA上，以利翻译的起始。根据首次识别其功能意义的科学家而命名。

    19．稀有密码子(rarecodons)  在不同种类的生物中，各种tRNA的含量上的差异很大，产生了对密码子的偏爱性，对应的tRNA丰富或稀少的密码子，分别称为偏爱密码子(biased codons)或稀有密码子。含稀有密码子多的基因必然表达效率低。微生物利用稀有密码子进行转录后调控主要反映在对同一操纵子中不同基因表达量的控制。

    20．重叠基因(overlappinggenes)  具有一些共用核苷酸序列的基因。重叠的序列可涉及到调控基因或结构基因。最早是在大肠杆菌噬菌体~X174中发现的，其许多不同蛋白质就是由重叠基因合成的。

    21．反义RNA(antisense RNA)  具有调节基因表达功能的RNA。它具有与另一“靶”RNA或DNA互补结合的碱基序列，能特异性地与“靶”结合而抑制其活性。它参与许多调节系统，调节基因的表达，调节作用主要在翻译水平，也包括少数在转录或DNA复制前引物加工水平。

    22．信号肽(signalpeptide)  分泌蛋白质N末端一段由15—30个疏水氨基酸残基组成的肽。分泌蛋白质的分泌的信号肽假说认为：疏水性信号肽对于新生肽链跨越膜及把它固定在膜上起了一种拐棍作用，对分泌蛋白能及时完成转运和分泌十分重要。

    23．信号识别颗粒(signal recognation particle，简称SRP)  由6种信号识别蛋白质与单个RNA分子形成的核糖核蛋白颗粒，其作用是能与核糖体结合，并停止蛋白质合成，对翻译起负调节作用，与分泌的启动和抑制调控密切有关。

二、习  题

填空题

1．乳糖操纵子操纵区的核苷酸序列的反向重复结构是阻遏蛋白    的结合部位。

2．无论在原核生物还是真核生物中，DNA结合蛋白有几种共同的结构形式：    、    和    ，这些形式对于蛋白质准确地与DNA相结合是非常关键的。

3．原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，根据调控机制的不同又可分为    和       。

4．分解代谢物阻遏又被称为    ，这是因为    是首先被发现具有这种阻遏效应的物质。

5．分解代谢物阻遏实际上是    缺少的结果。如果在培养基中补充    ，阻遏现象可以被抵消。

6．当细菌处于一种氨基酸全面匮乏的“氨基酸饥饿”状态时，细菌会采取一种应急反应以求生存， 实施这一应急反应的信号，大量合成两种物质，它们是：      和     。

7．如果让大肠杆菌生长在较高的温度下(如42—50~C)，某些基因则迅速表达，诱导产生热激蛋白，这种现象称为    。

8．传感激酶在与膜外环境的信号反应过程中，本身    ，磷酰基团然后被转移到应答调节蛋白上，    的应答调节蛋白即成为阻遏蛋白。

9．入噬菌体感染宿主后最先转录，并合成一些调节蛋白，通过调节蛋白的作用，其他基因的转录或被激活或被阻遏，从而使它进入    或     途径。

10．遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的     ，它是指起始密码子AUG上游30—40核苷酸的一段非译区。

11．微生物的某些胞外酶的mRNA半衰期比较       ，可在转录终止后仍然能够继续翻译，从而增加基因的     。

12．微生物利用稀有密码子进行转录后调控，主要反映在对同一操纵子中不同基因       的控制。

13．大肠杆菌含有两种受渗透压调节的膜蛋白OmpC和OmpF，在高渗透压时，OmpC合成增多，OmpF的合成受到抑制；在低渗透压时则相反，但两种蛋白质的总量保持不变，其中起调节作用的就是       。

 14．微生物转录水平的调控一般都是蛋白质或某些小分子物质对基因转录的阻遏或激活，而在翻译水平上也发现了类似的      作用。

 15．某些核糖体蛋白mRNA的部分二级结构和rRNA的部分二级结构相似，当rRNA短缺时，多余的核糖体蛋白质与本身的mRNA结合，从而阻断本身的翻译，同时也阻断同一多顺反子的 mRNA下游其他核糖体蛋白质编码区的翻译，使      的合成和       的合成几乎同时停止。

 16．疏水性信号肽对于新生肽链跨越膜及把它固定在膜上起了一个拐棍作用，信号肽在完成功能后，随即被一种特异的    水解。

  选择题4个答案选1

    1．无论在原核生物还是真核生物的DNA结合蛋白的结构形式中，不同于螺旋—转角—螺旋和锌指，“亮氨酸拉扣”本身(    )DNA作用，而是保持另外两个。螺旋在正确的位置与DNA结合。 (1)与  (2)不与   (3)可能与   (4)都与

    2．原核生物的基因调控主要发生在转录水平上，在负转录调控系统中，调节基因的产物是 (    )，起着阻止结构基因转录的作用。   (1)效应物    (2)代谢产物    (3)辅阻遏物    (4)阻遏蛋白

    3．实验证实：降解物敏感型操纵子都是由(    )调节的。  (1)cAMP—CAP  (2)代谢产物    (3)ATP    (4)阻遏物

    4．当细菌处于氨基酸缺乏时，导致出现空载tRNA，这种空载tRNA会激活焦磷酸转移酶，使 (    )大量合成，其浓度可增加10倍以上。    (1)ATP    (2)应急蛋白质    (3)cAMP    (4)ppGpp和pppGpp  

    5．枯草杆菌通过有序的(    )更换，使RNA聚合酶识别不同基因的启动子，使与孢子形成有关的基因有序地表达。    (1)基因    (2)信号肽    (3)口因子    (4)调节蛋白

    6．接受甲基趋化性蛋白(MCPs)是一些细菌的感受蛋白，也是(    )之一，负责传递化学感受信号穿过细胞膜。

    (1)阻遏蛋白    (2)激活蛋白    (3)跨膜蛋白质    (4)酶蛋白

    7．A噬菌体的c／基因是一种自我调节基因。当细胞内CI蛋白含量过高时，可阻止c／基因表达，  所以溶源性状态下的入噬菌体在不经诱导的情况下，也会以极低的频率进入(    )。  (1)细菌染色体上  (2)裂解循环    (3)突变循环    (4)溶源化状态

8. 遗传信息翻译成多肽链起始于mRNA上的RBS，在RBS中有SD序列，其功能是与核糖体16SrRNA的3，端互补配对，使核糖体结合到(    )上，以利翻译的起始。  (1)mRNA    (2)多肽链    (3)氨基酸    (4)RNA

9．在许多放线菌抗生素合成基因与该抗生素的抗性基因之间存在(    )现象，有的可以采用抗性基因作为探针从基因文库中去分离到抗生素合成基因。  (1)基因不重叠    (2)基因重组    (3)基因突变    (4)基因重叠

10．革兰氏阴性细菌的大多数分泌蛋白中，包括质膜多肽、周质多肽和外膜多肽都有(    )。 (1)短杆菌肽    (2)信号肽    (3)肽聚糖    (4)谷胱甘肽

是非题

1. 许多来自噬菌体、细菌的不同的DNA结合蛋白显示出螺旋—转角—螺旋结构，例如，噬菌体λ阻遏蛋白、大肠杆菌Lac和Trp阻遏蛋白等。

2. 大肠杆菌的lac i基因与乳糖操纵子的作用是典型的负控阻遏系统，因为在这个系统中，i基因是调节基因，当它的产物——阻遏蛋白与操纵区结合时，RNA聚合酶便不能转录结构基因，即在环境中缺乏诱导物时，乳糖操纵子是受阻的。

3. 大肠杆菌色氨酸操纵子转录是通过操纵区和阻遏蛋白控制的，当色氨酸供应不足时，阻遏物失了所结合的色氨酸，从操纵区上解离下来，trp操纵子的转录就此开始。这个系统是典型的负控诱导系统。

4. 大肠杆菌麦芽糖操纵子的调控是典型的正控阻遏系统，这里麦芽糖是诱导物，激活蛋白只有与麦芽糖结合时才能与DNA的特殊结合位点结合，促使RNA聚合酶开始转录。

5．分解代谢物阻遏中，葡萄糖进入细胞后，胞内的cAMP水平下降，RNA聚合酶不能与启动子结合，操纵子就不表达。

6．大肠杆菌的rRNA的操纵子上有两个启动子P1和P2，细菌在对数生长期时，P1起始的转录产物比P2大3—5倍，所以n是强启动子。但是当细菌处于氨基酸饥饿的紧急状态时，细胞内ppGpp浓度增加，这时P1的作用被抑制，由P2启动少量的rRNA的合成，以维持生命的最低需要。

7．σ⁷⁰基因作为σ操纵子的一部分而转录多基因的mRNA，但σ⁷⁰基因本身还有一个热激应答启动子，σ⁷⁰基因在热激应答反应中大量表达，这一情况与细菌的热激应答反应需要σ⁷⁰密切相关。

8．当MCP未与引诱物结合时，该复合物刺激CheA自身磷酸化，进而再使CheY和CheB两个细胞质蛋白也磷酸化，CheY—P与鞭毛传动器结合，启动鞭毛／顷时针旋转，细菌作翻筋斗运动。如果引诱物结合到MCP上，则CheA的自身磷酸化被抑制，CheY不能与鞭毛传动器结合，此时鞭毛逆时针旋转，细菌则进行直线运动。

9．当溶源菌受到紫外线等因素作用时，由于DNA上造成损伤，RecA蛋白具有切割阻遏蛋白的活性，使CI蛋白被切割，亚基被破坏，CI蛋白从DNA上脱落，于是RNA聚合酶便有机会与cro基因的启动子结合，表达Cro蛋白，使转录向裂解方向进行，即Cro蛋白阻止cI基因的表达，起负调控作用。

10．同一种微生物细胞中不同蛋白质的mRNA的稳定性相差很大，mRNA的稳定性是影响翻译效率的一个很重要的因素，基因的表达量与mRNA的半衰期成反比例关系。

11．大肠杆菌质粒ColEI的复制是受反义RNA调节的例证之一，因为RNAI能够与质粒DNA复制时的引物RNA结合，所以DNA聚合酶不能与引物RNA结合，致使质粒复制受阻，这样，RNAⅠ 通过调节RNA引物数目来对DNA的复制实行控制。

12。分泌的启动和抑制调控与SRP有关，由于$RP暂时中止这些分泌蛋白的转录，能确保这些蛋白质未达到细胞膜或内膜之前不能完成转录，这样，在信号肽和SBP的共同作用下，使得这些分泌蛋白能及时完成转运和分泌。

    问答题

    I．简述负控诱导和正控诱导两种操纵子转录调控的差异。

    2．为什么说乳糖操纵子的功能实际上是在正、负两个相互独立的调控体系作用下实现的?

    3．在负控系统中，如果操纵区缺失，将会发生什么情况，在正控系统中又将怎样呢?

    4．为什么弱化作用只影响合成代谢，而阻遏作用既影响合成代谢途径也能影响分解代谢途径’

    5．原核生物只有一种RNA聚合酶，通过什么途径识别不同的启动子并进行不同基因的转录?举例说明。

    6，解释为什么无义密码的功能在蛋白质的合成中为终止位点，而在mRNA的合成中就不能作为终止位点

三、习题解答

    填空题

    1。二聚体    2．螺旋—转角—螺旋结构  锌指结构  亮氨酸拉扣结构    3。负转录调控  正转录调控    4。葡萄糖效应  葡萄糖    5．cAMP  cAMP    6．鸟苷四磷酸(ppGpp)  鸟苷五磷酸(pppGpp)    7  热激应答反应    e．磷酸化  磷酸化    9．裂解  溶源    10．核糖体结合； 序列{RBS)    11．长  表达量    12．表达量    ]3  反义RNA    14．蛋白质阻遏    15．核糖体蛋白质  rRNA    16  信号肽醇

 选择题

 1．(1)    2，(4)    3．(1)    4．t4)    5．(3)    6．(3)    7．  (2)    8．  (1)    9  (4)    10  {2}

 是非题  1．  十    1。  一    3．  一    4。  一    5．  十    6．  十  7．  一    8。  十    9．  十    10    一    11．  十    12．  一

问答题

1．两者的主要差别在于：①调节基因的产物在负控中是阻遏蛋白，在正控中是激活蛋白。②阻遇蛋白的结合位点是操纵区，激活蛋白的结合位点是激活蛋白结合位点。

2．虽然乳糖操纵于是典型的负控诱导系统．在环境中如果有乳糖或类似物，就可诱导转录，但是如果没有CAP-cAMP  调控因子与操纵子相应部位的结合，乳糖操纵子即使在有诱导物的存在下，也不能转录，所以它是受双重控制的。

3．在负控诱导系统中，如果操纵区缺失，将发生组成型的合成利用乳糖的酶。在负控阻遏系统中，则实际上是形成了抗阻遏突变，无论阻遏物是否存在，细胞均能不断合成终产物(如色氨酸在正控诱导系统中，激活蛋白的作用部位不是操纵区，故不受影响。

4．因为弱化作用是受氨酰—tRNA的控制，是氨基酸合成代谢途径中的一种调控作用；而阻遏作用中，操纵子是受阻遏蛋白的控制，是调节基因的产物，在分解代谢(乳糖的分解)和合成代谢(色氨酸的合成)中均存在。

5．原核生物的RNA聚合酶通过与不同的σO因子结合组成全酶后才进行工作的。不同的口因子协助RNA聚合酶识别不同的启动子，并启动转录。例如：大肠杆菌在正常的条件下，σ⁷⁰．TM因子指导RNA聚合酶的活成，如果大肠杆菌生长在较高的温度下，便产生σ³²，由σ³²参人构成的RNA聚合酶全酶能够识别热激应答基因的启动子，刺激产生大量的热休克蛋白质，保证细胞不受高温的伤害。此外，枯草芽孢杆菌中通过利用大量不同的σ因子识别不同的启动子，从而控制芽孢的形成过程也是研究得比较详细的例子。    ·

6．这里涉及两个基本概念：转录和翻译。蛋白质的合成(即翻译)是以mRNA为模板，通过氨酰—tRNA将其遗传密码翻译成为多肽顺序的复杂过程，当核糖体到达3种无义密码子(UAA、UAG和UGA)中的任何一个时，由于没有任何氨酰—tRNA与这些终子密码结合，所以不能将这些密码翻译成氨基酸，肽链的合成便被终止。在mRNA的合成(转录)中，是以DNA为模板，通过RNA聚合酶催化合成RNA的过程。即以一条DNA链为模板，按照碱基互补的原则进行转录，不涉及终止密码。转录的终止是通过终止子(terminator)而实现的。

第十章 微生物与基因工程

一、术语或名词

1、基因工程(gene engineering)  或重组DNA技术(recombinantDNAtechnology)是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或合成的基因经过改造，插入载体中，导人宿主细胞内，使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生物表现出新的性状。

2．基因文库(genomiclibrary)  是指生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。文库中的每二个克隆只含基因组中某一特定的DNA片段。一个理想的基因文库应包括该生物染色体基因组全部遗传信息(即全部DNA序列)。一般适用于原核微生物基因的分离。

3。cDNA文库(cDNA library)  是指生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。cDNA文库中的每一个克隆只含一种mRNA信息。一般适用于真核微生物基因的分离。

4．多克隆位点(multiplecloningsite)  是克隆载体上一个带有不同限制酶单一识别位点的短66DNA片段，外源基因可随意插人任何一个切点。多克隆位点常位丰一个基因的编码区之中，因此，基因的插入失活极易被检测到。

5．穿梭质粒载体(shuttleplasmid vector)  是一类同时含有两种细胞的复制起点(特别是同时含有原核生物与真核生物的复制起点)，能在两种生物细胞中进行复制的质粒载体。

6．附加体质粒(episomal plasmid)  酵母穿梭质粒载体的一种，载体含有来自细菌质粒pBR322的复制起点并携带作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Amp’)。此外还有来自酵母21xm质粒的复制起点以及一个作为酵母选择标记的URA3基因(尿嘧啶核苷酸合成酶基因)，这种质粒既可在大肠杆菌中也可在酵母细胞中复制，重组质粒导人酵母细胞中可进行自主复制，且具有较高拷贝数。

7．复制质粒(replicating plasmid)  酵母穿梭质粒载体的一种，质粒含有来自细菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Amp’)和四环素抗性基因(Tet’)。还有来自酵母染色体的自主复制序列(ARS)，以及作为酵母选择标记的URA3基因和TRPl基因(色氨酸合成酶基因1)，能在大肠杆菌或酵母细胞中复制，重组质粒导入酵母细胞中可获得中等拷贝数的质粒。

8．整合质粒(integratingplasmid)  酵母穿梭质粒载体的一种，质粒含有来自大肠杆菌质粒pBR322的复制起点和作为大肠杆菌选择标记的氨苄青霉素抗性基因(Amp’)、四环素抗性基因(Tet，)。以及来自酵母的URA3基因，它既可以作为酵母细胞的选择标记，也可与酵母染色体DNA进行同源重组。这种质粒可在大肠杆菌中复制，但不能在酵母细胞中进行自主复制。一旦导人酵母细胞，可整合到酵母染色体上，成为染色体DNA的一个片段。

9．人工染色体(artificialchromosome)  是利用已知染色体结构和功能的必须组分，人工构建的小于天然染色体但能在宿主细胞中像正常染色体一样复制、分离和传递的DNA结构。酵母人工染色体(yeastartificialchromosome，YAC)，是由酵母染色体端粒、着丝粒、自主复制序列以及选择标记基因(如TRPl和URA3等)构成的线状DNA。是一类目前能容纳最大外源DNA片段人工构建的载体。细菌人工染色体(bacteriaartificialchromosome，BAC)，是以F因子为基础的载体，容纳的插入片段可达300kb。由于是低拷贝质粒，克隆DNA较稳定，没有酵母人工染色体的嵌合现象。易通过电击转移到大肠杆菌中。

10．限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease)  或简称为限制性酶(restrition enzyme)，是指能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶。

二、习  题

填空题

1．基因工程的基本过程是                            ，     阳性重组子的筛选   基因的测序和鉴定+基因的控制表达。目的基因的获得可以通过构建基因文库或cDNA文库来筛选目的基因片段，        文库一般适用于原核微生物基因筛选，      文库一般适用于真核生物基因筛选。

2．原核生物大肠杆菌的克隆载体中，能够容纳最大的外源DNA片段的载体是      ，可容纳DNA片段大小为      ；酵母质粒载体都是利用      质粒与细菌质粒pBR322构建而成的，主要有    、    和    3种。目前能容纳最大外源DNA片段的载体是    。

3．基因工程操作需要用一些基本的工具酶，它们大多数来源于各种微生物。如基因与载体的切割    和连接要用各种    酶和    酶，DNA的体外合成、测序要用     酶、      酶；RNA反转录要用    酶等。

4．克隆载体宿主是外源基因能够在细胞中大量扩增和表达的基本要素。宿主细胞非常重要的特性是不具有    ，不能降解导人的未经修饰的外源DNA；不具有    ，使克隆载体DNA与宿主染色体DNA之间不发生同源重组。目前最常用的原核克隆宿主是    和    真核克隆宿主是    。

5．外源DNA导人原核细胞可以采用以下3种方法：    方法，即重组质粒载体导人感受态细胞；    方法，即重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒导人感受态细胞；    方法，即外源DNA被包装成A噬菌体颗粒导人宿主细胞。

6．酵母细胞、哺乳动物细胞和植物细胞外源DNA的导入都可以采用    方法，此外酵母细胞还常采用    方法，哺乳动物细胞和植物细胞还常采用    方法。

7．限制性酶的命名是根据分离出此酶的    而定的，即取    的第一个字母和    的头两个字母组成3个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。

8．重组体表型特征的鉴定常用的方法有    、    、    和    。

选择题／4个答案选1

1．大肠杆菌的克隆载体中，常规使用的质粒载体可以克隆的最大DNA片段是(    )。

    (1)300～400bp    (2)25 kb    (3)15 kb    (4)40kb

2．为了在酵母菌中表达外源基因的稳定性，通常使用的载体是(    )。

    (1)2 txm质粒    (2)附加体质粒    (3)复制质粒    (4)整合质粒

3．下面的哪个选项不适合作为基因工程克隆载体(    )。

    (1)转座子    (2)质粒    (3)柯斯质粒    (4)噬菌体

4．人工染色体必须具有的元件是(    )。

    (1)染色体端粒    (2)着丝粒    (3)自主复制序列    (4)以上三项全部

5．真核生物目的基因的获得不能采用的方式是(    )。

  (1)DNA文库筛选    (2)cDNA文库筛选   (3)PCR体外扩增    (4)DNA的合成

6．外源DNA导人原核细胞可以采用转染法，即(    )。

    (1)重组质粒载体导人感受态细胞    (2)重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒导人感受态细胞

    (3)外源DNA被包装成入噬菌体颗粒导人宿主细胞    (4)电转化法    ，

7．利用α—互补作用进行的重组体细胞的筛选中，含有外源DNA片段的重组体细胞在含有X—gal—IPTG平板中生长的菌落颜色是(    )。    (1)蓝色    (2)白色    (3)红色    (4)黄色。

8．外源DNA导人宿主细胞的方法中，不是依据转化方式原理而进行的方法是(    )。

   (1)重组质粒载体+感受态细胞    (2)重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒+感受态细胞

       (3)外源DNA被包装成A噬菌体颗粒+宿主细胞  (4)酵母质粒载体+酵母细胞的原生质体

是非题

1．所有生物的目的基因的获得都可以从该种生物的DNA文库中直接进行筛选。

2．所有基因工程中的工具酶都是微生物来源的。

3．大肠杆菌是最常用的各种生物基因克隆载体构建的宿主菌。

4．任何一种微生物的野生型菌株细胞都可以作为克隆宿主。

5．所有微生物产生的限制性内切酶切割DNA后，都产生黏性末端。

6，把重组DNA载体导人宿主细胞中，电转化法可以适合各类生物细胞。

7，非电击条件下，把重组DNA载体导人大肠杆菌细胞中所依据的原理是转化和转导。

8．如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，则具有抗性的细胞肯定是重组

  体细胞。

问答题

1．从基因工程的基本过程和基因工程的应用及展望两个方面来说明微生物与基因工程的关系。

2．为什么DNA文库可以直接用于原核生物的目的基因筛选，而不能用于真核生物的目的基因筛

  选?真核生物的目的基因筛选常用的方法是什么?

三、习题解答

填空题

1．目的基因的获得  重组载体的构建  重组载体导人宿主细胞  基因  cDNA    2．柯斯质粒载

体  45kb  21xm  附加体质粒  复制质粒  整合质粒  人工染色体    3．限制性内切  连接

Taq  pfuDNA高保真聚合  反转录    4．限制修饰系统  DNA重组系统  大肠杆菌  酿酒酵母

5．转化法  转染法  感染法    6．电穿孔法  原生质体转化法  微量注射法    7．微生物学名

  微生物属名  种名    8．抗生素平板法  插入失活法  插入表达法  口—半乳糖苷酶显色法

选择题／4个答案选／／

1．  (3)    2．  (4)    3．  (1)    4．  (4)    5．  (1)    6．  (2)    7．  (2)    8．  (3)

是非题

1，  一    2．  一    3．  +    4．  一    5．  一    6．  +    7．  +    8．  一

问答题

1，基因工程的基本过程：目的基因的获得+重组载体的构建斗重组载体导人宿主细胞+阳性重组子的筛选+基因的测序和鉴定斗基因的控制表达。每一个环节都离不开微生物的参与。微生物世界的多样性为人类的活动提供了取之不尽、用之不竭的基因来源；基因工程的克隆载体通常由病毒、噬菌体和细菌质粒DNA改建而成；基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的；基因工程中最重要、最广泛应用的克隆载体宿主是原核生物的大  肠杆菌及真核生物的酿酒酵母。植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，在大肠杆菌中完成外源基因或重组体DNA的拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中。大肠杆菌表达系统、酵母菌表达系统和哺乳动物细胞表达系统都是采用重组细胞通过微生物发酵罐的方式大量生产目的蛋白。基因工程的应用表现在基因工程药物、基因治疗、改造传统工业发酵菌种、动植物特性的基因工程改良及环境保护中各个方面，并已经取得了丰硕的成果。同时基因工程也推动了微生物学的发展，特别是对于新的微生物资源的开发，认识和了解微生物世界中更多的微生物种类、微生物代谢、微生物遗传等将产生积极的影响。

2．由于真核生物基因组十分庞大，因此要求构建基因文库的库容量要足够大，才能筛选到某一目的基因。细胞中的mRNA分子数要比基因组的基因数小得多(通常大约仅有15％左右基因被表达)。由mRNA逆转录为cDNA，那么所构建的cDNA文库的库容量相应比基因文库小。

真核生物的基因含有内含子，在原核生物细胞中不能表达，但筛选到的cDNA克隆只要附上原核生物的调节和控制序列，就能在原核细胞内表达。常用方法：cDNA文库筛选，mRNA反转录后PCR体外扩增，DNA合成等。

第十一章 微生物的生态

一、术语或名词

1. 生态系统(ecosystem) 在一定的空间内生物的成分和非生物的成分通过物质循环和能量的流动互相作用、互相依存而构成的一个生态学功能单位。

2．生物地球化学循环(biogeochemicalcycles)  生物圈中的各种化学元素，经生物化学作用在生物圈中的转化和运动。

3．固氮作用(nitrogenfixation)  大气中氮被转化成氨(铵)的生化过程。

4．氨化作用(ammonification)  有机氮化合物转化成氨(铵)的生化过程。

5．硝化作用(nitrification)  好氧条件下在无机化能硝化细菌作用下氨被氧化成硝酸盐的过程。

6．嗜热微生物(thermophilicmicroorganisms)  最适生长温度在45℃以上，中温条件下能生长(或不能生长)的微生物。

7．嗜冷微生物(psychrophilicmicroorganisms)  最适生长温度在20~C以下，0~C或低于0℃可以生长，20℃以上生长或不生长的微生物。

8．嗜酸微生物(acidophilicmicroorganisms)  生长最适pH在3—4以下，中性条件不能生长的微生物。

9．嗜碱微生物(alkaliphilicmicroorganisms)  生长最适pH在9以上，中性条件不能生长的微生物。

10．嗜盐微生物(halophilicmicroorganisms)  生长最适盐浓度在0．2～0．25 mol／L以上的微生物。

11．嗜压微生物(barophilicmicroorganisms)  需要高压才能良好生长的微生物。

12．根际微生物(rhizospheremicroorganisms)  邻接植物根土壤区域中生长的微生物。

13．菌根(mycorrhiza)  一些真菌和植物根以互惠关系建立起来的共生体。

14．共生固氮(symbioticnitrogenfixation)  根瘤菌和植物根通过它们相互作用形成成熟根瘤固定大气中氮的复杂生理生化过程。

15．生物气溶胶(bioaerosols)  悬浮在大气中的气溶胶、微生物、微生物副产物和花粉的集合体。

16．生物降解(biodegradation)  微生物(也包括其他生物)对有机化合物(特别是环境污染物)的分解作用。

17．降解性质粒(catabolicplasmids)  编码难降解有机化合物降解酶的质粒。

18．污水处理(wastewatertreatment)  利用微生物在特定生物反应器中降解有机污染物净化污水的生化过程。

19．活性污泥法(activatedsludgeprocess)  利用由微生物与污水(废)水中的有机、无机固体物混凝交织、形成的活性污泥处理污水的过程。

20．生物膜法(biofiltration process)  在生物滤床中利用附着在滤料表面的生物膜净化污水的过程。

21．堆肥化处理(compostingtreatment)  有控制地在反应器中利用微生物转化有机废弃物(生活垃圾及其他有机固体废弃物)向稳定的腐殖质转化的生物化学过程。

22．生物修复(生物整治)(bioremediation)  用生物学介导的方法，主要利用微生物、植物从特殊环境中(尤其是原位)除去或降解污染物从而消除污染、修复污染环境的工程化处理过程。 

二、习题

填空题

  1．从    ，    ，    ，    生境中可以分离到嗜热微生物；从      ，     ，生境中可以分离到嗜冷微生物；从    、    生境中可分离到嗜酸微生物；从    ，      ，生境中可分离到嗜碱微生物；从     、      和    生境中可分离到嗜盐微生物。

  2．磷的生物地球化学循环包括3种基本过程：        、      、       。

  3．微生物种群相互作用的基本类型包括：      ，      ，       ，       、      、      、    和    。

  4．嗜热细菌耐高温的      使DNA体外扩增技术得到突破，为      技术的广泛应用 提供基础。

  5．微生物推动的氮循环实际上是氮化合物的氧化还原反应，其循环过程包括     ，       ，      和      。

  6．按耐热能力的不同，嗜热微生物可被分成5个不同类群：      ，       ，       ，     和      。

  7。有机污染物生物降解过程中经历的主要反应包括       ，       ，       和      .。

  8．评价有机化合物生物降解性的基本试验方法是      和      。

  9．污水处理按程度可分为      ，        和       。

  10．汞的微生物转化主要包括3个方面      ，       和        。

  选择题／4个答案选I／

  1．总大肠菌群中不包括(    )。    (1)克雷伯氏菌    (2)肠杆菌    (3)埃希氏菌    (4)芽孢杆菌

  2．下列有机物中最难被微生物降解的是(    )。    (1)纤维素    (2)木质素    (3)半纤维素    (4)淀粉

  3．同化硝酸盐还原的酶可被下列哪种化合物抑制?(    )    (1)氨    (2)氧    (3)N，    (4)N：O

  4．异化硝酸盐还原的酶可被下列哪种化合物抑制?(    )    (1)氨    (2)氧    (3)N，    (4)N，O

  5．活性污泥法处理污水的过程最类似于下面哪种微生物培养方式?(    )

    (1)恒浊连续培养    (2)恒化连续培养    (3)恒浊分批培养    (4)恒化分批培养

  6．和豆科植物共生固氮的微生物是(    )。    (1)假单胞菌    (2)根瘤菌    (3)蓝细菌    (4)自生固氮菌

  7．许多霉菌在农副产品上生长时易于产生霉菌毒素，下列中哪些条件最适于产生霉菌毒素?(    )

    (1)高温高湿    (2)高温    (3)高湿    (4)低温

  8．适用于生物冶金的微生物类群主要是(    )。(1)嗜热微生物 (2)嗜冷微生物 (3)嗜酸微生物  (4)嗜压微生物

  9．超嗜热细菌主要是(    )。    (1)古生菌    (2)真细菌    (3)真菌    (4)霉菌

  10．酸矿水的形成是微生物对某些金属和非金属元素转化的结合，下列哪种循环与酸矿水形成有关?(    )。

    (1)S循环    (2)N循环    (3)磷循环    (4)硅循环

  是非题

    1．氨化作用只能在好氧环境下才能进行。

    2．反硝化作用完全等同于硝化作用的逆过程。

    3．一般情况下土壤表层的微生物数量高于土壤下层。

    4．嗜冷微生物适应环境生化机制之一是其细胞膜组成中有大量的不饱和、低熔点脂肪酸。

    5．嗜酸微生物之所以具有在酸性条件生长的能力是因为其胞内物质及酶是嗜酸的。

    6．嗜碱微生物具有在碱性条件下生长能力的根本原因是其胞内物质及酶也是偏碱(嗜碱)的。

    7．草食动物大部分都能分泌纤维素酶来消化所食用的纤维素。

    8．共生固氮和游离固氮都在固氮过程中发挥重要作用。

    9．大量服用抗生素的患者同时要服用维生素，这是为了补充因肠道微生物受抑制减少维生素的合成。

  10．降解性质粒携带有编码环境污染物降解酶的全部遗传信息。

  问答题

1．具有甲基化无机汞能力的匙形梭菌的维生素B，：的缺陷型菌株不能进行汞的甲基化，而且对无机汞比亲株(野生型)要敏感得多，这说明什么?

2．微生物在从绿色植物到草食动物的能量流动中起重要作用，请指出这样说的理由?

3．简述微生物作为重要成员在生态系统中所起到的重要作用。

4．简述生物修复中的强化措施。

5．在含有难降解污染物污水的生物处理中，向污水处理系统加一定量高效降解菌的生物强化(过去称为投菌法)可以提高处理效果，请从微生物群落组成和功能的角度作出理论解释。

6．某一化学农药厂合成一种化学农药，请你提一种实验方法来评价这种农药的生物降解性。

7．污水处理也可以说是一种微生物培养过程，试从微生物的基质利用、培养方式和培养目的与微生物的工业发酵进行对比。

8．请对细菌遗传转化的概念作出解释，并说明如何利用人工转化技术获得高降解、高竞争能力的降解菌。

9．微生物分子生物技术可以在哪些方面给环境保护带来新的发展和应用。

10．活性污泥法处理污水的过程非常类似于恒浊的连续培养，那么两者是如何实现恒浊，其不同点在哪里?

三、习题解答

填空题

1．热泉  高强度太阳辐射土壤及岩石表面  堆肥  煤堆  极地  深海  酸矿水  酸热泉  碳酸  盐湖  石灰水  盐湖  盐场  盐矿    2．有机磷转化成溶解性无机磷(有机磷矿化)  不溶性无机磷变成溶解性无机磷(磷的有效化)  溶解性无机磷变有机磷(磷的同化)    3．中立生活  偏利作用  协同作用  互惠共生  寄生  捕食  偏害作用  竞争    4．DNA多聚酶  PCR    5． 固氮  氨化作用  硝化作用  硝酸盐还原(反硝化作用)    6．耐热菌  兼性嗜热菌  专性嗜热菌  极端嗜热菌  超嗜热菌    7．氧化反应  还原反应  水解反应  聚合反应    8．微生物学方法  环境学方法    9．一级处理  二级处理  三级处    lo．无机汞(Hg”)的甲基化  无机汞(Hg”)还原成Hg‘  甲基汞和其他有机汞化合物裂解并还原成Hg’

选择题    1．  (4)    2．  (2)    3．  (1)    4．  (2)    5．  (1)    6．  (2)    7。  (1)    8．  (3)    9．  (1)    10．  (1)

是非题    1．  -    2．  -    3．  +    4．  +    5．  一    6．  -    7．  -    8．  +    9．  +    10．  —

 问答题

1．一方面说明维生素B12在汞的甲基化中起重要作用，维生素B12(钴胺素)和甲基形成一种甲基钴胺素复合物，而Hg2’可以夺取甲基钴胺素中的甲基形成甲基汞。另一方面说明甲基汞对梭菌的毒性比无机汞要低，所以不能形成甲基汞的缺陷型菌株对无机汞更加敏感。

2．大部分草食动物都缺乏分解绿色植物的纤维素酶，而草食动物对植物食料的利用依靠的是生长在它们胃肠道中的微生物，微生物分泌的纤维素酶把纤维素分解成脂肪酸及其他营养物质，这些营养物质为动物吸收利用，草食动物(如牛)的瘤胃共生就是微生物帮助草食动物利用绿色植物的明显例证。

3．微生物在生态系统中可以在多个方面起重要作用，但主要作为分解者。其重要作用可以概括如下：①微生物是有机物的主要分解者，微生物分解存在于生物圈内的动物、植物和微生物残体等复杂有机物质，并转化成最简单的无机物，再供初级生产者利用。②微生物是物质循环中的重要成员，微生物参与所有的物质循环，大部分元素及其化合物都受到微生物的作用。③微生物是生态系统中的初级生产者，光能营养和化能营养微生物具有固定太阳能和化学能的能力，成为生态系统的初级生产者。④微生物是物质和能量的贮存者，生态环境中的微生物贮存着大量的物质和能量。⑤微生物是地球生物演化中的先锋种类，微生物是地球上最早出现的生物体，微生物的活动为后来的生物进化打下基础。

4．强化措施主要包括：①接种外源微生物，通过接种外源高效的降解微生物，改变降解微生物结构、数量，提高降解能力。②添加微生物营养盐，为降解微生物提供充足均衡的营养，提高微生物活性。③提供电子受体，提供充足的氧和硝酸盐等作为好氧、厌氧条件下的电子受体。④提供共代谢底物，为难降解有机物污染的降解提供代谢底物，促进降解。⑤提高生物可利用性，利用表面活性剂、分散剂提高污染物的溶解度，促进生物降解。⑥添加生物降解促进剂，一般加入各种氧化剂推动污染物的降解过程。

5．向处理系统投加高效降解菌从而提高了高效降解菌在整个降解菌群中的比例，改变了整个降解菌群的群落结构，结构决定功能，随之整个群落的降解功能也就得到提高。

6．化学农药主要用于防治农作物的病虫害，农药的生物降解主要体现在土壤中的生物降解。因此生物降解可以在土壤——植物组成的微宇宙中进行。把农药按标准使用量溶解后洒入宇宙，即时测定土壤中的农药的含量，以后按一定时间间隔取样分析测定土壤中农药的浓度，这样即可测出农药在自然土壤中的生物降解速率，从而知道这种农药的生物降解性。

7．污水处理和微生物工业发酵的基质从根本上来说是一样的，工业发酵的基质是人工配制的易于为微生物利用的营养物，而污水处理中的营养物则是污水中各种有机物，有的易于利用，而有的是难降解的。从培养方式来说，工业发酵一般是不连续的批式培养，而污水处理是连续进行的。就培养目的而言，工业发酵的目的是收获有用的代谢产物，产物可以存在于发酵液或菌体中，而污水处理的目的一般是使微生物降解污水中的各种有机物，降低其中的有机物含量，其目的主要在净化方面。

8．遗传转化是指同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程。获得高效高竞争能力的降解菌的方法可以先筛选到对污染物的高效降解菌，要使这些菌株具有竞争力，主要的办法是使它们获得系统中的土生菌的竞争能力。因此，一般的方法是把处理系统的优势土生菌的DNA提取出来，而后处理高效降解菌达到感受态吸收土生菌的DNA，这样就可获得高效高竞争能力的降解菌。

9．微生物分子生物技术可以给环境保护带来多个方面的发展和应用，主要包括：①构建具有更强的降解能力的遗传工程菌，降解各种环境污染物，特别是难降解的环境污染物。②利用分子标记技术跟踪监测降解微生物在环境中的行为。③利用分子生物技术监测环境中的有害微生物。④从分子水平上研究环境污染物对生物大分子(特别是DNA、RNA)的作用。⑤选育转基因的优良动、植物品种减少农药、化肥用量，减缓环境污染。

10．活性污泥法处理污水过程的恒浊主要是维持曝气池中活性污泥有相对稳定的浓度，实现的方法是回流二次沉淀池沉降的污泥。恒浊连续培养实现恒浊的方法是调控培养器中流人、流出液的流速，使培养液中的微生物浓度基本恒定。其不同点在于前者靠回流维持污泥浓度恒定，后者则靠调控流速维持。