龙袍图片:普洱茶热脱附——裂解色谱指纹图谱研究

:《云南省第二届普洱茶国际研讨会文集》张铭光，袁敏，袁鹏，朱洁民，陈超摘
普洱茶（Pn—er tea）原产于中国云南省西双版纳地区，由大叶种茶(Camellia sinena).Ktze. var. assamica Kitamura）渥堆和陈化等特殊工艺加工而成。普洱茶汤红褐，具有陈香、味醇厚等特点，具有消肉食，逐风痰，泄热，解毒，生津止渴等功能，深受国内、东南亚、日本和欧洲茶叶市场的欢迎。不同产地的普洱茶由于所用原料、加工方法等的不同，品质风格有较大的差异，经渥堆、陈化和库藏后，茶的生化成分和品质发生明显变化。目前多用感官审评，水浸出物含量、氨基酸含量、多酚类含量、咖啡碱含量、粗纤维含量、茶色素测定等方法鉴定普洱茶品质。然而，普洱茶的制作经历了复杂的生化变化过程，茶叶的色、香、味是多种物质综合作用的结果，这种基于成分的协调，互补或制约，起着宏观调控作用的特点，需要用综合的，宏观的，非线性的分析观念和质量控制模式来适应，上述鉴定结果显然有其局限性。以热解吸——裂解色谱手段测试植物的指纹图谱，计算机软件图象处理分析技术是一种新的质量检测方法。该技术在中药现代质量控制方面蓬勃发展，我们已用该方法对多种中药做品质鉴定。该方法的主要特点是热解析法可以把植物中的挥发组分解吸出来，而裂解手段是把植物中不易挥发的大分子物质如蛋白质、纤维素、多糖、生物碱等裂解成小分子化合物，然后通过气相色谱分离技术获得丰富的指纹信息。由于不同植物所含的化合物有差异，其指纹信息也不同，而可以通过其指纹图谱去分辨不同植物。国外巳开展采用裂解色谱法分辨植物的工作，但用于普洱茶品质鉴定未见报道。本文尝试选择热脱附——裂解色谱技术研究不同产地、不同制作方法和不同存放年限的普洱茶的指纹特征，并用计算机软件对指纹图谱进行合理化处理，采用模糊聚类法对谱图进行分析比较；同样的热解温度、热解时间等操作参数及图谱的重现性进行研究。
1、实验部分
1.1 仪器与测试条件
Trace－DSQ气－质联用仪（FINNIGAN），GC—16A气相色谱仪，氢火焰离子化仪器（FID），PRY－2A裂解装置（Shimadzu）。色谱柱：25m * фO.32mm OV－石英毛细管柱（中国科学院兰州化学物理研究所）。
柱温Tc：60℃(5min)——>230℃（25 min），检测器温度TD；250℃，进样器温度：230℃;热解温度：200～350℃；进样量：50mg；扫描电压：70 meV，离子化温度：250℃，传输线温度：250℃。
1.2 样品及制备
样品来源：多种不同产地、不同存储年限、不同存放地点、不同制作工艺的普洱茶叶（茶艺乐园＜中国＞有限公司提供）。
制备：分别取各种茶叶5g，研磨粉碎，备用。
2、结果与讨论
2.1 实验条件的研究
2.1.1 热解温度对实验的影响选择同一种样品，其它测试条件不变，在不同热解温度下进行测定，结果见图1。从图中看到：温度在200℃时，产生少部分挥发物，谱图中最后一个峰是咖啡因，但峰值较低，说明此时热裂解温度偏低，很多大分子物质还没产生裂解；温度达350℃时，随温度上升，大部分物质产生裂解，咖啡因峰值较高，基本没产生裂解，此时指纹图谱信息量较多；当温度达450℃时，由于一些物质发生二次裂解，同时咖啡因峰也开始产生裂解，大部分物质最终生产二氧化碳、水、小分子得酚类物质，使色谱峰主要集中在前面，谱图信息量开始减少，导致各样品间得裂解指纹图谱差异减小，不利于比较样品。

图1 裂解温度对谱图的影响
对于植物样品，由于其本身所含物质的复杂性，在一定的温度下，热脱附和热解效应同时发生，所以在保证信息量的前提下，热解温度尽量低些，在本实验热解温度选择350℃较合适。
2.1.2 热解时间对谱图的影响选择同一样品，其它条件不变，改变热解时间进行测定，结果见图2。从图中可看到，热解时间在5～30s间，随着时间的增加，谱图的信息量增加；35～50s时，出峰数基本保持不变，而且色谱峰主要集中在前面，50s后，能产生裂解的物质减少，有些热解产物发生二次反应。经反复试验，我们认为在保证指纹图谱信息量较多的前提下，热解时间应越短越好，所以普洱茶的热解时间定在30s为宜。
2.2 普洱茶指纹图谱的研究
2.2.1 普洱茶裂解色谱－质谱的测定
选择存储年限为40年的普洱茶，按实验条件1.1测定其裂解产物。结果表明：裂解产物第一部分是二氧化碳、水。第二部分是苯酚、甲基苯酚、二甲基苯酚、羟基丙烯基苯酚、邻甲氧基苯酚、羟基甲氧基苯-醛，还有一些是裂解不完全、分子量较大的产物，如三甲基十二碳醇、3－羟基十二碳酸、四甲基十六烯醇，第三部分是没有产生裂解的咖啡因。在指纹图谱分析中，我们主要选用第二、三部分产物做比较。
2.2.2 谱图重现性的测定 取9号样品5份，在同一条件下测定，考察色谱峰相对留值（a）和峰强度（T）的一致性，结果表明：各色谱峰a的相对标准偏差RSD均
<=2.73％，T的相对标准偏差RSD均<= 11.54％
2.2.3 不同工艺生产的普洱茶的指纹图谱测定及聚类分析10种不同产地和不同工艺生产的普洱茶作为供试样品并编号，见表l。选用热脱附／裂解色谱法在1.1测定条件下对不同工艺生产的普洱茶作指纹图谱测定，结果表明，普洱茶裂解色谱峰有60多个，其中各种普洱茶的共有峰占98％。选择Hr，（各组分峰高与共有峰峰高之和的比值）＞1％的61个共有峰进行比较，发现不同普洱茶的指纹图谱裂解的组分基本相同。主要差异是组分的含量不同，因而其指纹信息就不一样。

图2 热解时间对出峰数影响
选择含量较一致，所有样品都共有的峰32为参照峰，设各组分的调整保留值与峰32的调整保留值的比值为a，分别求出各组分的a值和Hr值，由模糊聚类分析法分析，得出聚类图，见图3。
图中相关系数越大，表示谱图相似度越高。图3显示，相关系数为0.92时，荷香与熟普同类；相关系数为0.86时，荷香、熟普、广东普、老头、青普和樟香同类。
依此类推，当相关系数为：0.75时，供试的10个样品归为一类。同时还发现生普与熟普有较大的区别，而生普间的差异又比熟普间的差异大。野樟与野生普属野生普洱茶，它们与其它8个样品的差异也较大，相关系数＜0.8，这与感官审评一致。罗龙新等指出，普洱茶渥堆过程中，发生了以茶多酚为主体的一系列复杂剧烈的化学反应，在微生物的胞外酶酶促作川下，形成普洱茶特有的色香味品质特征。不同工艺生产的普洱茶由于所用原料、加工方法等的不同，品质风格有较大差异，可见，普洱茶的热脱附／裂解色谱指纹图谱能较好地反映不同工艺生产的和不同产地的普洱茶的差异。
2.2.4 不同存储年限普洱茶的指纹图谱测定 普洱茶的后发酵是一系列酶促氧化和微生物活动复杂的变化过程。茶叶中的主要生化成分在酶促作用和湿热作用下，发生了氧化、缩合、分解、降解，以及各产物之间又发生聚合、缩合等一系列化学反应，绝大部分脂溶性色素已转化为水溶性物质。

表一 普洱茶编号

图3 普洱茶聚类图
选择同一产地、同一存放地，存放时间分别为10、20、30、40、80年的普洱茶，样品号分别以1、2、3、4、5表示，用同样的测试方法测定其指纹图谱,并采用用模糊聚类法分析。实验结果如图4。图4显示，存放20与30年的相关系数为0.78。存放10与20、30、80年的相关系数为0.74，而存放40年的与10、20、30、8O年的相关系数相差最大，为0.56。说明普洱茶在存放期间，40年的茶叶变化最大，其它理化化测试结果也表明存放40年的普洱中水溶性茶多酚、茶色素含量较高。另外我们也发现，随着存放年限的增加，普洱茶中咖啡因含量增高。存放40年的普洱茶滋味较醇，但超过40年的普洱茶，多酚类含量降低，黄酮糖苷含量较低。周红杰等认为长期储存的普洱茶不含茶黄素，而咖啡因含量增高。
2.2.5 不同存放地点及不同存放方式的普洱茶指纹图谱测定 普洱茶在加工过程中与茶叶的老嫩、气温、空气湿度、季节、发酵场地有关，即使是同种原料在不同地域加工，其品质也有差异。选择同种茶叶，不同存储地点，不同存储湿度的普洱茶，按测试条件1.1测定其色谱指纹图谱。由于植物所含的组分不均匀性引起进样误差，同时也为了能更直观地表示指纹图谱，我们设计软件画出色谱峰强度（T）与棒状指纹图（图5），其中T＝log（各组分百分峰高+1）。图5表明，存放于云南干仓的普洱茶有79.1％的指纹峰的T值高于广东于仓的，主要物质是茶多酚、茶色素裂解的产物，与罗龙新指出的云南普洱茶条黄素、茶红素、茶褐素较广东普洱茶含量高的结果一致，但云南普洱茶的咖啡因含量较广东的低；而在广东存放3年，存于湿仓的普洱茶裂解指纹峰的T值有78.6％高于存于干仓的，其中有15个峰高出20％以上，主要集中在a＝O.469～1.122之间，有8个峰高出30％以上。说明存于湿仓普洱茶其茶多酚、茶色素较干仓的多，可溶性精含量也相对较高。这是由于高湿条件下，微生物生长旺盛，有利于大分子碳水化合物分解成小分子可溶性糖类物质，而咖啡因含量则减少。

图4 不同年限普洱茶聚类图

广东干仓存放、广东湿仓存放、云南干仓存放的普洱茶棒状指纹图谱
图5 不同存储地点普洱茶色谱指纹棒状图
3、结语
采用热脱附／裂解色谱指纹图谱法把植物中大分子组分裂解成小分子组分，虽然植物成分受到破坏，但不同的植物都有其特有的裂解指纹信息，同时有些挥发组分可通过热脱附解吸出来，这样可获得更丰富的指纹信息。