镇雄县以勒镇:金黄色葡萄球菌肠毒素产量的优化工艺

金黄色葡萄球菌肠毒素产量的优化工艺

杨玉涛

专 业：食品科学与工程   学 号：2007464211  指导老师：张英慧

摘要：实验旨在探求金黄色葡萄球菌肠毒素的产生情况、测定方法以及制备最佳工艺。选取标准金黄色葡萄球菌纯化菌种，依国标GB/T4789-10-94液体透析培养法进行肠毒素的培养提取，根据肠毒素的蛋白质特性，利用紫外光分光光度法跟踪肠毒素的产量曲线。结果显示在产毒培养48h，振荡培养温度为40℃，菌种培养30h条件下肠毒素产量最大，单个菌落肠毒素产量为14.505mg。生产工艺中产毒培养时间和振荡培养时间以及菌种培养时间对肠毒素产量的影响较大。

关键词：金黄色葡萄球菌；肠毒素；产量；优化工艺

Abstract：The purpose was to explore the production situation, assay method and the preparation technology of staphylococcal enterotoxins. The standardard production method of Staphylococcus aureus was chosen according to GB/T4789-10-94, and the output was assessed by ultraviolet spectrophotometry. The results showed that the largest production of staphylococcal enterotoxin was 14.505mg per colony. The optimium process was shaking toxicogenic incubation at 40℃ for 48 h, followed by strain incubation for 30 h. And the time of oxicogenic incubation, shaking culture and strain incubation exerted great influence.

Key words: Staphylococcus aureus; Staphylococcal enterotoxins; output; optimium process

恶性肿瘤（简称肿瘤）是威胁人民健康、危及人民生命的严重疾病。据统计，对于最佳工作时期（35-60岁）人群死因调查中肿瘤居首位。在我国，近年来癌症死亡率顺位上升，城市已是第一位，农村是第三位。人们经过一个多世纪的努力，还是没有征服癌症。

1981年，世界卫生组织癌症顾问委员会指出：利用掌握的方法和技术，1/3的癌症是可以预防的，1/3的癌症如早期诊断是可以治愈的，1/3的癌症是可以减轻痛苦，延长寿命的。30多年已经过付出了，总体上来说这个论断没有成为现实，世界范围的癌症发病率和死亡率仍在上升。但随着医学的进步和发展，使大约80%~90%的癌症得到确诊，而且使1/3的癌症患者能在早期被发现。这些早期癌症患者中，90%可以得到根治。

目前，对 SE已有广泛的基础研究。在这一方面我国科研人员已经在SAg的研究上作了大量的基础与临床应用工作，从金葡菌代谢产物中提取抗肿瘤的有效成分，在带不同癌瘤的动物体上进行了不同剂量的抗肿瘤临床观察，已取得了较满意结果。利用基因重组技术提示，各剂量的重组SEA均能显著抑制肿瘤的生长(P<0.001)。重组SE的高、中、低剂量治疗组的抑瘤率分别为79.3%，75.6%，73.8%，而中剂量原位注射的抑瘤率高达90.6%。这提示超抗原靶向治疗较直接利用，其抗癌效果更好^[1]。

程慧桢等^[2]用金黄色葡萄球菌肠毒素协助无水酒精局部注射治疗肝癌发现能够增强肝癌患者局部抗肿瘤细胞免疫；肿瘤患者局部细胞免疫影响其预后状态；能够进一步降低该治疗方法治疗原发性肝癌的近期复发率。

Perabo等^[3]对SEB应用于膀胱癌的灌注治疗进行了临床前评估，结果表明SEB能够有效杀伤肿瘤且未见毒副作用出现。在本研究中，用SEA注射荷瘤小鼠，能够有效抑制肿瘤的生长，而尤以中剂量原位注射(每只鼠110 ng)效果最佳。这表明，将SAg进行局部给药或加以靶向修饰，可较好地应用于肿瘤的治疗。

也正由于SE具有独特高效的诱导机体抗肿瘤免疫反应的特性，把它作为抗肿瘤生物制剂，应用于抗肿瘤疗法中，将会有广泛的应用前景，也必将会取得更快更显著的进展^[4,5]。

因此，研究肠毒素尤其是开展肠毒素的检测以及量的提取扩增，可用于肠毒素的疾病预防和抗癌产品的研发，对于临床医学抗肿瘤有重要意义。

本试验主要工艺是采用国家标准GB/T4789-10-94规定的金黄色葡萄球菌肠毒素检测方法中的液体透析培养法进行肠毒素的提取，并利用紫外分光光度法进行肠毒素产量的测定^[6]。利用正交设计选取出肠毒素产量最大化的工艺条件，方便以后抗癌产品的制备。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 25923-3）；营养琼脂；氯化钠；蒸馏水；透析袋（截留分子量14000，规格：扁宽2.5cm；上海源聚生物科技有限公司，批号：080406）；肠毒素产毒培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司，产品编号：HB4120）；标准牛血清白蛋白（BSA）（上海伯奥生物科技有限公司，编号：G0050）；细麻绳。

1.2 设备和仪器

1.2.1 仪器

试管（180mm x 18mm）、250ml锥形瓶、棉花塞、胶头滴管、玻璃棒、石棉网、小烧杯、接种环、移液管、吸球、离心管、量筒、酒精灯

1.2.2 设备

电子万用炉（北京市永光明医疗仪器）；手提式压力蒸汽灭菌器 YX-280B型（合肥华泰医疗设备有限公司）；单人净化工作台 SW-CJ-1D型；振荡培养箱 PYX-190Z-C型（科力仪器）；恒温培养箱培养箱 PYX-250H-B型（科力仪器）；离心机 Anke TGL-16G(上海安亭科学仪器厂)；Spectrumlab 752S 紫外光分光光度计；T500型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）。

1.3 方法和原理

1.3.1 方法

采用GB/T4789-10-94中规定的液体透析培养法从菌体培养液中提取出肠毒素，由于金黄色葡萄球菌肠毒素是一种蛋白质，所以采用紫外吸收法测定溶液中蛋白质的含量来测定溶液中金黄色葡萄球菌肠毒素的含量^[7,8]。

1.3.2 原理

金黄色葡萄球菌肠毒素都是简单的蛋白质，它们水解后能释放出18种氨基酸，其中赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和酪氨酸的含量最高。因蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在280nm处具有最大吸收且各种肠毒素蛋白质在这三种氨基酸的含量差别不大。因此测定蛋白质溶液在280nm处的吸光度值是最常用的紫外吸收法^[9]。

1.3.3 步骤

1.3.3.1 标准曲线的绘制

将常用的标准蛋白质牛血清白蛋白（BSA）制成浓度为1.0mg/mL的溶液取6支试管，按编号加入试剂；用第一管为空白对照，各管溶液混匀后在紫外分光光度上测定吸光度A₂₈₀，以A₂₈₀为纵坐标各管的蛋白质浓度为横坐标作图^[9]。

1.3.3.2 产毒培养时间对肠毒素产量的影响

将金黄色葡萄球菌菌株接种营养琼脂斜面，培养24h，再加入已制备好的产毒培养基中，在37℃下振荡培养如图2中不同时间段，测定肠毒素的浓度，经计算得出肠毒素的含量如图2。

1.3.3.3 不同处理条件下对肠毒素产量的影响

研究三个因素（如表1）共同作用对肠毒素产量的影响，选取产量最多的水平搭配。进行正交设计试验，选取的不同处理条件如表2

表1  不同处理条件的三因素四水平

因素

水平

产毒培养时间（h）

24

36

48

60

振荡培养温度（℃）

25

30

35

40

菌种培养时间（h）

12

18

24

30

表2  正交设计三因素四水平的搭配

不同处理代号

产毒培养时间（h）

振荡培养温度（℃）

菌种培养时间（h）

1

24

25

12

2

24

30

18

3

24

35

24

4

24

40

30

5

36

25

18

6

36

30

12

7

36

35

30

8

36

40

24

9

48

25

24

10

48

30

30

11

48

35

12

12

48

40

18

13

60

25

30

14

60

30

24

15

60

35

18

16

60

40

12

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

用紫外分光光度计测得各个试管中标准蛋白质牛血清白蛋白（BSA）的A₂₈₀值，绘制成标准曲线图为图1。

图1  蛋白质浓度标准曲线

从中可以直观的得出该标准曲线的回归方程式为y=0.7101x + 0.0048,R2=0.9998>0.95,精确度高。从此方程式中，可以利用测得的OD值直接算出肠毒素的浓度。

2.2 产毒培养时间对肠毒素产量的影响

从图2中可以得出在其他条件固定不变的情况下，仅考虑产毒培养时间与肠毒素产量的关系。从单因素方差分析标记结果中得出0h-48h之间互呈显著关系，整体呈上升趋势，而48h-64h之间肠毒素产量趋于略微上升的稳定状态，但差异不显著。从图表分析中直观看出肠毒素的产量从刚开始的0mg到8h、16h、24h，缓慢上升，24h至32h之间，产毒量增加较多。之后产毒培养48h、56h时肠毒素的产量趋于稳定，达到最高峰，产量为3.447mg（按接种单个菌落培养计）。因此，就单因素试验中，产毒培养时间为48h时，肠毒素的产量最大，为单因素的最佳条件。

                    图2  产毒培养时间与肠毒素产量的关系            图3  三因素正交试验对肠毒素产量的影响

2.3 不同处理条件下对肠毒素产量的影响

将经过不同处理的提取液倒入石英比色皿中，用蒸馏水做空白对照，在紫外分光光度计上直接读取280nm的吸光度值A₂₈₀，利用标准曲线查出提取液中肠毒素浓度，在通过计算得出肠毒素的量。不同处理条件肠毒素产量如图3。

本试验属于正交设计的完全随机模型，从图3中正交设计方差分析表看到三个因素的F值明显大于F临界值，由此得出这三个因素极显著，说明产毒培养时间、振荡培养温度、菌种培养时间这三个因素对试验效果影响较大。从试验处理因子1（产毒培养时间）各水平间差异显著性检验中得出该因子各水平间极显著；从试验处理因子2（振荡培养温度）各水平间差异显著性检验中得出第一个水平和第三个水平不显著，其他水平间差异显著；试验处理因子3（菌种培养时间）各水平间差异显著性检验中得出该因子各水平间差异极显著；从试验处理因子4和5（空闲因子）各水平间差异显著性检验中得出部分水平间仍有显著差异，由此说明试验结果存在一定误差，主要是因为本试验结果的数据比较小，故存在的试验误差较大。从各个处理间差异显著性检验中看出各处理间差异极显著，部分处理间差异显著。

结合显著性分析，可以初步得出处理12为优方案。

从表3结果中表明：极差分析得出三个因素对试验结果的影响程度为产毒培养时间>振荡培养温度>菌种培养时间，其中产毒培养时间这个因素对本试验最为重要；在本次三因素四水平正交试验设计中，其优方案为A₃B₄ C₄，即采用在产毒培养时间48h，振荡培养温度40℃，菌种培养时间30h条件下，肠毒素产量最大，高达14.505mg。该试验结果和其他正交处理间差异显著，故产毒培养时间48h，振荡培养温度40℃，菌种培养时间30h为本次正交试验中的最优条件。

表3  三因素四水平方差分析中得出的结果

水平

产毒培养时间（A）

振荡培养温度（B）

菌种培养时间（C）

K1

K2

K3

K4

R

优方案

4.225

3.356

8.778

7.769

5.422

A₃

4.859

6.314

4.976

7.980

3.121

B₄

4.835

6.501

5.469

7.323

2.488

C₄

3.讨论

我们的预备试验初步测出金黄色葡萄球菌产生肠毒素。李献和马家斌将临床分离筛选的产毒金黄色葡萄球菌^[10]，接种于蘑菇罐头中，发现金黄色葡萄球菌在蘑菇罐头中生长良好，培养12h后即进入对数生长期，培养30h后达到生长繁殖高峰，然后进入衰老和死亡期。当菌数达到10⁷个/mL时即可检测出肠毒素，随后大量积累，培养18h及以各阶段肠毒素检测结果均为阳性，说明随着金黄色葡萄球菌的不断生长和繁殖，不断产生肠毒素。

一般提取液中肠毒素的含量为30.95mg～40.18mg^[11,12]，其含量相对较高，而本试验测得肠毒素产量仅有14.505mg，相对偏低。主要是所选取的产毒培养基成分不同，一般是选用杜尔曼氏葡萄球菌产毒培养基进行培养，而本试验考虑成本问题，选用的是普通肠毒素产毒培养基。由此表明本试验采用的肠毒素产毒培养基未能完全符合金黄色葡萄球菌肠毒素的生物合成条件。

金黄色葡萄球菌可分泌20多种毒性蛋白质^[13]，所产生的重要毒素有溶血毒素（α、β、γ、δ），杀菌细胞素，溶表皮素和肠毒素；侵袭性酶类主要用有血浆凝固酶、脱氧核糖核酸酶、脂肪酶、磷酸酶、透明质酸酶、胶原酶和溶纤维蛋白酶等。

由以上可以得知金黄色葡萄球菌产生的蛋白质除了肠毒素还有很多品种，因此在进行肠毒素测定时，需对金黄色葡萄球菌中的其他蛋白质进行排除。否则测出的肠毒素的量就不精确。

例如杀菌细胞素是一种不耐热的蛋白质^[14]，且苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬氨酸及赖氨酸的含量各不相同与肠毒素有异，可不考虑或通过加热的方法来排除。

脂肪酶^[15]在培养温度30℃的情况下产生的量较多，应尽量避免这个温度，而本试验刚好肠毒素产量最大不在此温度下，所以脂肪酶的影响不大。假如肠毒素最大产量是在30℃下，那么就要对其加以排除。而其他酶类的产量很少，可以粗略不考虑。

4.小结

本试验通过单因素试验和正交试验研究了金黄色葡萄球菌肠毒素产量最大的工艺，确定了最佳工艺条件。最佳工艺条件是产毒培养48h，振荡培养温度为40℃，菌种培养30h，在此处理条件下测得的肠毒素产量最大，单个菌落肠毒素产量为14.505mg。

本试验中肠毒素的测定方法具有简便快捷且成本低，同时也利用正交设计筛选出了肠毒素产量最大化的工艺条件。但仍存在不足之处，主要是菌种培养时菌落数难以精确以及测定过程中容易受其他蛋白质的干扰。

SE作为一种新型的抗肿瘤治疗手段，实验研究的总体效果比较好，目前正逐步应用于临床，在抗肿瘤免疫治疗中展示了良好的应用前景。

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