应急灯种类:【资料】兴奋剂类分析方法系列讲座(40讲 待续)

兴奋剂类分析方法系列讲座（26）（下）微波萃取-气相色谱法测定尿液中的苯丙胺类毒品

2. 2. 4　溶剂用量对萃取率的影响

　　分别取环己烷2, 4, 6, 8, 10, 12 mL 作为萃取溶剂，在40 ℃下萃取10 min, 其余步骤同“1.5.1”节所述。结果表明:随着萃取溶剂用量的增加,萃取率明显增加,大于6 mL 以后,萃取率变化不大。故环己烷用量选择6 mL。

2. 2. 5　尿液pH值对萃取率的影响

　　取6 mL 环己烷作为萃取溶剂,在40 ℃的萃取温度下保持10 min，分别调节尿液的pH值为9， 10，11， 12，13和13.7,其余步骤同“1.5.1”节所述,结果(见图3)表明:在尿液的pH 值大于12 时, 萃取率变化不大。故选择pH值为12。



2. 3　标准曲线和最低检出限

　　向空白尿液中加入MA, MDA 和MDMA 的混合标准溶液,配制尿液中3种药物质量浓度分别为0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 m g /L 的系列标准溶液。按“1.5.1”节方法处理样品, 然后进行GC-F ID 分析。以药物峰面积(A )对药物质量浓度(C, m g /L )绘制标准曲线, 并求得直线回归方程和相关系数。最低检出限为按“1.5.1”节步骤处理样品所能检测到的尿液中的药物浓度(以3倍信噪比计算) , 结果见表1。3 种药物浓度为3 m g /L的日内和日间回收率和精密度见表2, 其中日内 ( In traday)为1 d 内重复测定5次的回收率和精密度, 日间 ( In te rday)为5 d 内冻融5 次测定的回收率和精密度。



2. 4　方法的回收率及精密度的测定

　　取空白尿液,准确加入MA,MDA 和MDMA 的混合标准溶液, 分别配制药物浓度为1, 3, 5 m g /L的尿液各5份,按“1.5”节所述两种方法处理样品,并进行GC-FID 分析,计算平均回收率和精密度,结果见表3。


2. 5　在法医案例中的应用

　　将该方法应用于测定法医案例中6例吸食苯丙胺类毒品者的尿液中MA,MDA 和MDMA 的含量,并且与公安部物证鉴定中心提供的数据(采用GC-MS测定)进行了比较。分析结果见表4 (括弧中的数据为公安部物证鉴定中心提供的数据,“ + ”为阳性结果) ,其中2号样品为冰毒吸食者的尿样,色谱图见图12c; 3号样品为摇头丸吸食者的尿样, 色谱图见图12d。



2. 6　GC-M S 定性分析

实验过程中,为了进一步增强检验结果的可靠性,我们还同时采用GC-MS 的全扫描模式对微波萃取的吸食苯丙胺类毒品者的尿液样品进行了分析。根据其保留时间和质谱图进一步确定了检材中的毒品成分。图4为表4中2号样品的总离子流色谱图和质谱图(冰毒的主要成分为MA,MA 的代谢产物为苯丙胺(AP ) ) ,图5为表4中3号样品的总离子流色谱图和质谱图(摇头丸的主要成分为MD 2MA,MDMA的代谢产物为MDA ) 。



3　结论

　　本文采用微波萃取技术对人体尿液中甲基苯丙胺、3, 42亚甲二氧基苯丙胺和3, 42亚甲二氧基甲基苯丙胺3种常见的苯丙胺类毒品的分析进行了研究,通过对微波萃取溶剂、萃取温度、尿液pH 值等微波萃取条件的优化,建立了同时检测人体尿液中甲基苯丙胺、3, 42亚甲二氧基苯丙胺和3, 42亚甲二氧基甲基苯丙胺的微波萃取2气相色谱分析方法。该法简单快速、高效,重现性好和回收率高。将该方法应用于6例苯丙胺类毒品滥用者的尿液的检测,

获得了理想结果。

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50#  只看作者  回复于：2009-11-10 11:26:31 回复本贴 回复主题 编辑 举报 管理 兴奋剂类分析方法系列讲座（31）液相色谱-串联质谱法鉴定  
  
液相色谱-串联质谱法鉴定

大鼠血浆中的阿托品及其代谢物



摘 要 目的：液相色谱-电喷雾离子阱串联质谱（LC –MS n）联用法鉴别大鼠血浆中的阿托品及其主要代谢物。

方法：取单剂量灌胃50 mg·kgˉ1阿托品的大鼠血样，甲醇沉淀蛋白，采用LC － MS及LC －MS n等方法分析血样。和空白血样及阿托品相比较，根据血样中代谢物相对分子质量的变化（ΔM r）及其多级质谱数据，鉴定并阐述其结构。

结果：在服药后的大鼠血样中发现5种代谢物，分别为托品、N一去甲基托品、脱水阿托品、氧化阿托品以及托品酸。

结论：该方法灵敏、快速、简便，适合于药物及其代谢物的快速鉴定。



前 言

药物代谢研究对于人们认识药物体内作用规律，指导临床合理用药以及新药设汁具有重要的意义[1]。LC-MS联用技术是现今对药物代谢研究的最有力的工具[2~4]，该方法具有灵敏度高、专属性好、样品处理简单、快速等特点，特别是多级质谱能够提供丰富的结构信息，能够在没有对照品的情况下进行代谢物的结构分析[5、6]。

阿托品（atropine）是从茄科植物颠茄（Atropabelladonna L）、曼佗罗（Datura stramonium L。）及莨菪（Hyosuamus niger L）中分离提取的一种托品烷类生物碱，有着广泛的药理活性．如解痉、麻醉、止痛等，主要用于抗休克及治疗心、肝、肺等疾病[7]，随着药理研究的进展，其用途越来越广。药用植物和药物中阿托品的含量测定［8，9］及其药动学研究已有报道［l0，11］ ，但其生物体的代谢研究很少[12]，没有对大鼠血浆中阿托品及其代谢物鉴定的报道。为全面阐明该药在生物体内的代谢过程，本文利用LC—MS n技术，对服药后的大鼠血样进行了直接定性分析，鉴定出了原药及其5种代谢物。



本文是湖北省杰出青年基金和湖北省中药生物技术重点实验室开放基金项目的部分内容，由陈怀侠l，2、杜鹏1、韩凤梅l、陈勇1（l，湖北大学中药生物技术省重点实验室；2．武汉大学化学与分子科学学院）等共同完成对阿托品的五种代谢物的研究，现全文介绍如下：



实 验

1 仪器与试剂

美国Finnigan公司LCQ离子阱型质谱仪，包括ESI（电喷雾电离）源，TSP P4000泵及TSPAS3000自动进样器；Highchem公司Mass Fronter

1．2质谱解析软件。

阿托品（美国Sigma公司）。甲醇为色谱纯（美国Fisher公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。



2 实验方法

2．1 阿托品对照品溶液

取阿托品对照品适量，以甲醇配制成浓度为1．0 mg·mL- l的储备溶液，再用流动相适当稀释后进行LC－ MSn分析。

2．2 生物样品的处理

6只健康Wister大鼠（200±10）g，购于湖北省实验动物研究中心，合格证：SCXK（鄂）2003 －2005。大鼠禁食12 h，按50 mg·kg- 1灌胃给药阿托品后，分别于5，45 min及2，18，24 h眼眶取血，肝素抗凝，5000 r·min -1离心l0min，上清液置于一70℃冰箱中保存备用。取各时间点的血浆，加3倍量甲醇沉淀蛋白，5000 r·min -1离心10 min，上清液过0.45μm微孔滤膜，滤液用于HPLC － MSn分析。

2．3 测定条件

2．3．1 色谱条件

Agilent Zorbax extend C18不锈钢色谱柱（3．0 mm×100 mm，3．5 μm），同种填料的色谱保护柱（2．1 mm×12．5 mm，5 μm，Agilent），流动相：甲醇:2 mmol·L－1醋酸铵水溶液（以甲酸调节pH 3．5）（70：30），流速0．2 mL·min -1，柱温40℃，进样量20μL。

2．3．2 质谱条件

ESI离子源，扫描范围：m／z 100～1000，离子源喷射电压4．5 kV，毛细管电压21 V，毛细管温度175℃，鞘气（N2）流速：40个单位。自动进样器直接进样，正、负离子方式检测；采用全扫描一级质谱（Full scan MS）及其源内碰撞诱导解离（S － CID）、全扫描二级质谱（Full scan MS2）及三级质谱（Full scan MS3）等方式进行测定。



3 结果与讨论

3．1 阿托品的LC － MS（MSn）分析

阿托品的一级质谱以分子离子峰m／z 290［M＋H］＋为基峰，没有聚合及其他加合现象（图1－A）。为进一步了解其二级质谱裂解规律，本文采用离子阱技术对阿托品的准分子离子，m／z 290进行多级质谱分析，其二级质谱（相对碰撞能量为30％）及其LC－ MS2全扫描色谱见图1 －B、C。由图1 －B可见，阿托品的分子离子失去一分子水产生碎片m／z 272［M＋H － H20］＋，而分子离子失去一分子甲醛产生碎片m／z 260［M＋H － HCH0］＋。其二级质谱中丰度最高的碎片m／z 124是其母分子离子失去托品酸（C9H10O3，相对分子质量Mr＝166）产生的。该碎片离子rn／z 124失去NH2CH3（Mr＝31）产生碎片离子m／z 93。而其二级碎片m／z 272和260的三级质谱中均出现m／z 124，93，91，由此说明，m／z 124，93，91是阿托品分子离子的特征子离子，Mr＝30和Mr＝166是其特征中性碎片丢失。这种特征子离子和特征中性碎片丢失是阿托品生物体内代谢物鉴定的依据。