子宫内膜干细胞研究进展

　　【摘要】 人类子宫内膜功能层在月经周期受体内激素的作用发生周期性的增生和脱落。早年即
有学者提出子宫内膜显著的增生能力可能源于子宫内膜干细胞的存在。大量的一临床观察和基础研究均提示，子宫内膜基底层存在上皮和基质两种类型的干细胞。尽管近年子宫内膜干细胞的分离与鉴定研究有了长足的进展，但子宫内膜干细胞的特异性标志物仍在探索中。子宫内膜干细胞可能成为子宫内膜过薄和内膜病变患者进行内膜修复替代治疗的手段；同时可为内膜异位症、子宫内膜癌等提供新的研究思路。
　　【关键词】 成体干细胞；子宫内膜；间充质干细胞
　　人类子宫内膜由上皮、腺体和基质组成，分为功能层和基底层。在雌、孕激素作用下随月经周期改变，子宫内膜由0．5～lmm增生至5～6mm，进而转变为分泌期内膜，随即脱落进入下一周期。绝经后和广泛切除子宫内膜的妇女用激素进行替代治疗均有内膜增生，因而早在1978年Prianishni—kov 提出存在子宫内膜干细胞，使子宫内膜功能层增生修复。随后多年的临床观察和细胞克隆等基础研究均证实了这一假说，并且进一步提示，子宫内膜干细胞位于基底层，存在上皮和基质两种类型的干细胞。现对子宫内膜干细胞的存在依据、来源、分离培养以及应用前景作简要综述。

　　1 子宫内膜干细胞存在依据

　　临床实践中发现功血妇女电切大部分子宫内膜后，内膜完全再生并可妊娠 ；子宫内膜异位症病灶虽为多中心起源但每一局部病灶细胞呈明显的克隆性，而具有克隆能力是干细胞的特征之一，提示子宫内膜异位症病灶可能是干细胞来源。2007年，Masuda等 进行异种移植研究，将人类子宫内膜上皮和基质混合群细胞移植到NOD／SCID小鼠肾包膜下，混合群细胞能在小鼠体内存活并增殖，含有人类腺体和基质，腺上皮表达孕激素受体并在雌激素作用下增生，给予孕激素后可进一步分化形成蜕膜，证实部分子宫内膜细胞在异种移植体系中能够自我更新，具有高度的增殖能力和一定的分化潜力，符合干细胞的标准。据此有学者提出子宫内膜组织中存在内膜干细胞的假说。与此同时，有关子宫内膜干细胞的基础研究不断发展。Chan等 最先通过对子宫内膜上皮和基质细胞克隆形成能力的鉴定证实了子宫内膜干细胞存在。研究发现，0．22% ～0．o7%的上皮细胞和1．25% ～0．18%的基质细胞培养15天形成的集落含细胞数大于50个。基质细胞较上皮细胞更易形成克隆，两者均可形成大、小集落。小集落含大且疏松排列的细胞，核质比率低，传代15～20代，增殖潜能有限，来源于短暂扩充细胞；偶见大集落，含细胞数大于4000个，细胞小且密集，核质比率高，可传代30～32代，具有高度的增殖潜能，提示来源于子宫内膜干细胞。Smalley等 发现，子宫内膜上皮细胞在增生期克隆活性增强，基质细胞在分泌期克隆活性则更强，间接提示内膜存在上皮和基质两种类型的干细胞。
　　由于目前尚未找到子宫内膜干细胞的特异性标记，分离和鉴定内膜干细胞成了一项非常有挑战性的工作。在不需干细胞标记的前提下，确定成体干细胞及其在壁龛中定位的一个可靠途径是应用LRC方法。2006年Chan等 在小鼠子宫内膜上皮中确定了标签滞留细胞群(1abel—retaining cell，LRC)，3% 的小鼠上皮细胞可被标记，上皮LRC群维持标记56天，存在于上皮腺腔中。Gargett 发现6% 内膜基质细胞可被标记，维持标记84天。40%LRC群邻近内膜与肌层连接区，位于血管周围。Cervel6等 发现9%基质细胞被Br．du标记达49天，112天后LRCs减至1．7% 。此外，约40%的基质LRC群表达o【一平滑肌肌动蛋白或CD31 ；1／3基质LRC群表达c—kit；10%基质LRC群表达Oct-4” ；16%的基质LRCs表达雌激素受体 。2007年Kato等 证实子宫内膜边缘群细胞(side population cells，SP细胞)的存在，通过分离sP细胞，经短期培养，sP细胞可分离出两个群落，一个含上皮细胞(CD9 )；另一个含上皮细胞和基质细胞(CD13 )。上皮SP细胞培养5个月后聚集形成腺样结构并表达CD9 和上皮细胞钙粘蛋白；培养6个月后形成CD13基质细胞群。sP细胞分化成两个成熟的内膜细胞类型为子宫内膜存在上皮和间质两种类型干细胞进一步提供了证据。

　　2 子宫内膜干细胞的来源

　　生殖腔起源于中胚层，部分间充质细胞转化为体腔上皮细胞，内陷形成米勒管或中肾管。胎儿时期未分化的子宫表层上皮内陷成为间充质，随后腺体形成；而未分化的平滑肌分化为间充质形成子宫肌层。Snyder和Loring” 认为成年后部分胎儿上皮和间充质干细胞遗留在子宫内膜使组织循环更新，即子宫内膜干细胞可能是胎儿干细胞遗留的产物。子宫内膜基质中有相当数量的细胞表达CD34，而CD34是一种最常见的骨髓干细胞标志物，骨髓干细胞不断循环，在多个器官出现” ，内膜干细胞极可能来源于骨髓干细胞。此外，在4名接受单抗HI|A非匹配骨髓移植妇女的内膜腺体和基质中发现有意义的嵌合，范围从0．2% 到52% ，供者细胞集中在腺体和基质，同时，部分嵌合腺体并非均为单克隆来源，多克隆腺体包含供者骨髓融合移植的内膜细胞。受者内膜上皮和基质不表达CD45，可与供者细胞区别。表明在一系列的细胞逆转和炎性刺激下骨髓干细胞有利于内膜
再生，骨髓来源的干细胞可能参与子宫内膜的增生修复 。此外，将雄鼠来源的骨髓干细胞移植入同种雌性小鼠体内，在补充雌激素的小鼠子宫内膜中发现带有移植物标记且角蛋白阳性的细胞，表明即使是雄鼠的骨髓干细胞也可以参与雌鼠子宫内膜的修复增生。骨髓干细胞是否可以转化为功能性的子宫内膜干细胞；骨髓干细胞是否在每一月经周期中均可规律的分化为内膜还不得而知；是否内膜局部损伤可使骨髓干细胞永久性的定居于内膜也有待研究。

　　3 子宫内膜干细胞的分离方法

　　较为常用的分离培养方法是将剪碎的子宫内膜组织块，加入DMEM／F一12，置于培养箱中18h。III型胶原蛋白酶消化、离心、40目钢筛过滤，收集基质细胞悬液，加入含5%胎牛血清的DMEM／F12培养基中。过滤后的碎片含腺体和肌层片段，继续上述消化45～60min，制成腺体细胞悬液，加入上述培养基中。用免疫磁珠方法分离细胞：BerEP4 分选上皮细胞；CD45一分选基质细胞。将收集的BerEP4 上皮细胞接种于6孑L培养板；CD45一基质细胞接种在成纤维饲养层的血清培养板，置于37℃ 、5%CO 孵箱中继续培养。上皮细胞3～4天；基质细胞6～7天换液1次。连续动态观察细胞生长及形态特征。培养5～6天后上皮和基质细胞均可形成大小两种集落。培养15天取出盖玻片，丙醛固定2min，PBS冲洗；3%H 0 消化内源性过氧化物酶10min，PBS冲洗；加入抗体(检测上皮细胞：加入鼠抗人CK 2 ml，鼠抗人CD49f101．Lg／ml，鼠抗人上皮细胞抗原4．7 ml；检测纤维细胞：鼠抗人成纤维细胞抗体3．1 ml，鼠抗人CD90 41．Lg／ml，鼠抗人胶原I 20~g／ml；检测内皮和平滑肌细胞：鼠抗人CD316i．~g／ml，鼠抗人aSMA 1．8 m1)湿盒4℃ 过夜；37℃ 复温lh，PBS冲洗后滴加生物素连接二抗，37℃ 孵育30min；PBS冲洗后DAB显色。上皮小集落表达BerEP4、CK、CD49f，表明来源于分化的上皮细胞；大集落BerEP4不表达、CK、CD49f弱表达，表明来源未分化的上皮干细胞。基质大小集落表达CD90，5B5及胶原I说明基质干细胞分化为成纤维细胞和成肌纤维细胞。应用此方法证明分离培养的子宫内膜上皮和基质细胞具有干细胞的分化特性并具有转化为其他内膜组织细胞的能力 。此外，Kato等” 用Hoechst 33342染色，利用流式细胞分析仪分离sP细胞以富集干细胞，再做进一步的培养鉴定。
上皮和基质细胞原代培养需生长因子PDGF—BB，EG，bFGF，LIF，SCF，HGF，IGF—I，TGFa，其中有3种生长因子有利于上皮和基质细胞形成克隆：血小板源性生长因子一BB(platelet—derived growth faetor—BB，PDGF—BB)、转化生长因子(transforming growth factor—d，TGF—d)和表皮生长因子(epider—mal growth factor，EGF)。上皮集落表达EGF受体，而成纤维饲养层上PDGF—BB受体利于PDGF—BB的细胞增殖作用，因此，成纤维饲养层利于上皮细胞形成集落；而基质集落表达EGF受体、PDGF受体和FGF2受体，故含FGF2的胎牛血清更利于基质细胞形成集落。
　　由于目前尚无特异性标记的抗体可将子宫内膜干细胞从其分化组织中直接分离出，多数学者都依靠在造血、神经、表皮或其它系统中的干细胞标记去研究子宫内膜干细胞。用RT—PCR的方法检测内膜MSC mRNA的表达，可观察到干细胞标记基因Oct-4。应用免疫组化方法在基底层腺体和基中检测到CD34，c—kit／CD1 17，bcl-2。通过磁珠分离或流式细胞分析有克隆能力的珠群已经排除了几个可能的标记，如骨髓MSCs标记：Stro一1；HSC标记：CD133；不表达造血细胞表面标志CD45、CD14、HLA—DR，内皮细胞表面标志vwF、Flk一1、CD31、KDR等，也不表达共刺激因子CD80、CD86、CIMOL等和某些胚胎干细胞表面标记SSEA-4、TRA·1_61、TRA一1-80。现阶段识别内膜干细胞的特异性标志物尚未找到，仍在探索中。

　　4 子宫内膜干细胞的应用前景

　　子宫内膜干细胞本身的生物学特性使它在组织替代治疗等方面具有广泛的临床应用前景。子宫内膜是胚胎发育的温床，子宫内膜过薄可阻碍受精卵在子宫内膜着床和发育，子宫内膜过簿是致妇女不孕的常见原因之一，对此症目前尚无有效的治疗方法。随着对子宫内膜干细胞研究的深入，内膜干细胞向组织细胞分化，治疗内膜损伤，为子宫内膜过薄和有内膜病变的妇女进行内膜修复将成为可能。干细胞介入治疗的优势表现在干细胞是人体细胞，具有自我扩增和分化能力，作为载体可进行组织修复，而且作为生命的最小单元，是导入组织的最佳形式。鉴于这些优点，子宫内膜干细胞介入治疗将是治疗内膜病变的重大突破。
　　子宫内膜干细胞数量，功能，调控和定位机制的改变还可能引发内膜疾病。在某些妇科疾病的发生发展过程中子宫内膜干细胞也起着举足轻重的作用。例如，最近Gar—gett 根据以往的研究结果提出子宫内膜异位症的发病可能与子宫内膜中的干细胞有关，异位子宫内膜病灶也可能是由子宫内膜基底层干细胞分化而来，或者内膜种植虽然存在，异位内膜病灶的维持和发展却是干细胞不断更新和分化的结果。这一学说如被证实，将可能为子宫内膜异位症的发病机理研究及临床诊疗研究提供新的作用靶点；还有学者提出，正常组织干细胞受多基因变异和／(或)内外环境变化可发展为癌干细胞。癌干细胞是恶性肿瘤组织中具有肿瘤形成能力的细胞，具有类似于正常干细胞的自我更新和无限增殖能力，以及进行不同程度的分化以衍生为普通癌细胞。子宫内膜干细胞在许多生物学特性上与癌干细胞相似，如形态、自我更新特性、共表达某些与内膜增生有关的基因等。
　　癌干细胞关键基因-FIEN基因在子宫内膜癌和内膜增生组织中存在，并且在子宫内膜癌组织中发现Wnt／．catenin信号通路，因此，研究子宫内膜干细胞将为子宫内膜癌的肿瘤干细胞研究奠定坚实的基础。
　　目前，我国尚未见子宫内膜干细胞研究的报道，国际上子宫内膜干细胞研究尚处在早期阶段，仍未解决干细胞标记的鉴定问题，因此，我们开展子宫内膜干细胞特异性标记的研究将是原创性的临床基础研究。此项研究上的进展和突破，将会使我国子宫内膜干细胞研究在国际上占有一席之地，也会给子宫内膜疾病患者带来新的希望。