Toll样受体2和9在单纯疱疹病毒感染发病中的作用研究

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导出 添加到引用通知 分享到| 下载PDF阅读器单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)感染是临床上常见的病毒性疾病，可累及口腔、眼、皮肤、中枢神经系统和外生殖器。近20多年来，HSV感染的发病率明显增加，且容易复发，已成为一个主要的公共健康问题。生殖器疱疹(genital herpes,GH)是一种由HSV引起的常见性传播疾病。孕妇感染HSV后，可通过胎盘，产道等途径感染胎儿及新生儿，导致流产、死胎和先天畸形等。新生儿HSV感染病情重，治疗不及时60％～70％感染者死亡。幸存者中后遗症发生率可高达95％。单纯疱疹病毒性脑炎(herpessimplex virus encephalitis，HSVE)是最常见的散发性脑炎，无特征性表现，进展快，未治疗病人的病死率超过70％。近年来发现唇癌和宫颈癌发生可能与HSV感染有关；在艾滋病病毒感染病人中HSV也是最常见的机会感染病原。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)是新近发现的一类重要的模式识别受体，通过迅速识别入侵的病原微生物，介导炎症反应，发挥抗感染作用，并进一步调控针对该病原体的获得性免疫反应。在TLRs家族中，TLR2和TLR9是目前研究较多的二种重要的模式识别受体。TLR9主要识别含非甲基化CpG基序的细菌和病毒。TLR2具有广谱识别能力，不但具有促进细胞因子的合成与释放、促进免疫细胞成熟、分化等作用，还在调节机体对入侵病原体的免疫应答水平及抗病毒方面有不容忽视的作用。目前HSV感染的发病机制尚不十分清楚。国外研究显示TLRs在HSV感染中起重要作用。多位学者采用基因敲除小鼠研究证明TLR2能识别HSV，介导了对HSV感染的炎症性细胞因子反应，而且TLR2介导的强烈炎症性细胞因子反应能引起宿主死亡。研究也发现HSV通过TLR9依赖性和非依赖性途径诱导产生IFN-α和IL-12，上调CD86共刺激分子。因此我们提出以下工作假设：HSV感染时，TLR2和TLR9识别HSV，激活TLR信号通路，触发天然免疫，通过一系列蛋白质级联反应激活转录因子NF-kB，刺激致炎性细胞因子产生，并参与和调控机体对HSV的免疫应答和炎症反应。由于目前有关HSV和TLRs的研究主要集中在动物实验，很少涉及药物治疗和临床研究。因此对于HSV感染时人体内所发生的病理变化和药物的治疗作用了解甚少，不利于临床对本病防治。本课题研究从HSV感染小鼠模型和HSV感染病人两个方面来研究，试图阐明TLRs在HSV感染发病中的的作用，TLRs与细胞因子的关系，抗病毒治疗后TLRs和细胞因子发生的变化，以及HSV感染动物模型和病人两者在发病机制上的差异。为临床上单纯疱疹病毒感染的诊断和治疗提供理论依据，为寻找新的治疗途径与靶点提供新的思路。 目的：研究TLR2和TLR9在HSV感染小鼠模型脑组织和病人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)上的表达水平以及血清IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α和IFN-β水平，来探讨TLR2和TLR9在HSV感染发病中的作用，探讨更昔洛韦对小鼠单纯疱疹病毒脑炎的保护作用和机制，探讨HSV感染与TLRmRNA表达、细胞因子水平的时效关系。调查儿童单纯疱疹病毒感染的血清阳性率。 方法：第一和第二部分(动物实验)：建立单纯疱疹病毒脑炎(HSVE)小鼠模型，采用RT-PCR检测HSVE小鼠不同感染时间脑组织TLR2和TLR9 mRNA的表达水平，同时用ELISA方法检测HSVE模型小鼠血清IL-8，TNF-α和IFN-β水平，观察HSV感染与脑组织TLR2，TLR9 mRNA表达，血清IL-8，TNF-α和IFN-β水平的时效关系，观察更昔洛韦干预后对这些指标的影响。第三部分(临床病例研究)：采用全血双色免疫荧光直标法，在流式细胞仪上检测生殖器疱疹和儿童复发性单纯疱疹病人PBMC上TLR2和TLR9表达水平。同时采用ELISA法检测其血清IL-6、IL-10和TNF-α水平。第四部分(流行病学调查)：采用ELISA法检测2436例在湖南省儿童医院门诊就诊和住院患儿血清中HSV抗体以及434例同一时段出生的所有新生儿脐血HSV抗体。所有数据采用SPSS11.5统计软件分析。 结果：①HSVE模型组和更昔洛韦干预组小鼠HSV检出率均为100％，HSVE模型组小鼠比更昔洛韦干预组发病快，症状严重，死亡率高，脑内病毒滴度明显升高。更昔洛韦对小鼠HSVE有保护作用。②HSVE模型组小鼠脑组织TLR2和TLR9 mRNA表达水平比正常对照组明显增加(P<0.001)，随着感染时间的延长，HSVE模型组小鼠脑组织TLR2和TLR9mRNA表达逐渐增加(P<0.05)；同时血清IL-8和TNF-α水平在感染后各时相均明显升高(P<0.001)，IFN-β水平在感染3天后开始升高(P<0.05)，且与TLR2和TLR9mRNA表达增加同步。提示TLR2和TLR9参与了HSVE时机体对病毒的识别，可能介导了HSVE小鼠血清IL-8、TNF-α和IFN-β的上调。③更昔洛韦干预组小鼠脑组织TLR2和TLR9mRNA水平比正常对照组明显增加(P<0.001)，而且随着感染时间的增加，TLR2mRNA表达逐渐减弱(P<0.01)，而TLR9mRNA表达逐渐增加(P<0.05)。与HSVE模型组比较，其TLR2mRNA水平在感染后第3天开始减弱，差异有显著性(P<0.01)；同时其血清IL-8和TNF-α水平在感染后各时相较HSVE模型组明显降低(P<0.001)，IFN-β水平明显升高(P<0.001)。提示TLR2可能参与了更昔洛韦的抗HSVE作用。④成人生殖器疱疹和儿童复发性单纯疱疹患者PBMC上TLR2和TIR9表达水平和两者双表达水平均显著增加(P<0.001)，同时其血清IL-6和IL-10水平也明显升高，TNF-α水平明显降低，差异有高度显著性(P<0.001)。结果提示TLR2和TLR9共同参与了对HSV的识别，激活TLRs信号通路，介导IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子反应。⑤正常儿童和儿童组病人PBMC上TLR2和TLR9表达水平均分别明显高于正常成人和成人组病人(P<0.001)。⑥葡萄球菌烫伤样皮肤综合征患儿PBMC表面TLR表达水平与正常儿童比较，TLR2、TLR9表达水平、TLR2和TLR9双表达均增加(P<0.05)，提示TLR2和TLR9同样识别金黄色葡萄球菌，在金黄色葡萄球菌感染中具有重要作用。⑦接受HSV抗体检测儿童患者中，HSV血清阳性率为44.55％(143/321)，HSV血清阳性率和HSV1血清阳性率随年龄而增加(P<0.05)，而且HSV阳性率女孩比男孩高(P<0.05)；临床诊断疱疹组HSV血清阳性率(61.14％)明显高于非疱疹组(12.73％)(P<0.005)。⑧新生儿脐血HSV血清学阳性率5.76％(25/434)。 结论：①更昔洛韦能有效抑制HSV-1DNA复制，对小鼠HSVE模型有保护作用，TLR2可能参与了更昔洛韦的抗HSV作用。②TLR2和TLR9可能参与了HSVE时机体对病毒的识别，触发了TLRs信号通路并释放IL-8、TNF-α和IFN-β等细胞因子，参与对HSV的天然免疫和HSVE的炎症过程。③在HSVE小鼠，脑组织TLRmRNA表达和血清IFN-β水平与HSV感染时间呈正相关。④TLR2和TLR9共同参与了儿童复发性单纯疱疹病人和成人生殖器疱疹病人对HSV的识别，激活TLR信号通路，通过一系列蛋白质级联反应激活转录因子NF-kB，引起IL-6、IL-10、TNF-α等细胞因子的释放，激活天然免疫细胞，导致HSV感染的免疫炎症反应。⑤儿童PBMC表面TLR2和TLR9表达水平明显高于成人。⑥TLR2和TLR9与葡萄球菌烫伤样皮肤综合征的发病有关。⑦儿童病人HSV血清阳性率随年龄而增加。儿童HSV感染以HSV1感染为主，新生儿以HSV2感染为主。⑧HSV血清抗体的检测有助于儿童单纯疱疹病毒感染的诊断。作者：汤建萍学科专业：儿科学授予学位：博士学位授予单位：中南大学导师姓名：杨于嘉学位年度：2008语 种：chi分类号：R752.11关键词：Toll样受体  单纯疱疹  病毒感染  更昔洛韦  HSV作用机标关键词：样受体    疱疹病毒感染    发病    单纯疱疹病毒    表达水平    细胞因子    血清阳性率    更昔洛韦    模式识别受体    作用    小鼠    儿童    病人    生殖器疱疹    模型    免疫    炎症反应    新生儿    脑组织    感染病