对偶制与专偶制:对人教版低温诱导植物染色体数目变化实验的改进

内容摘要：在人教版必修二《遗传与进化》模块中，变异来源染色体畸变后安排了一个实验《低温诱导植物染色体数目变化》的实验，教材中写到将洋葱4℃低温处理36h即可观察到染色体数目发生改变的细胞，但经过实践按照教材所示的方法很难观察到染色体加倍的现象。在理论上用低温处理分生组织细胞，能够抑制纺锤体的形成，以致影响染色体被拉向两极，细胞也不能分裂成两个字细胞，于是植物细胞染色体数目发生变化。在中国的帕米尔高原已发现有大量的天然多倍体植物存在,但在实验室低温诱导方面还是少有报道,因为条件不太好摸，也不稳定,重复性不好,出现率也不高。因此设计了一组不同低温和处理时间的实验，对低温诱导能否使植物形成多倍体进行探究，旨在为人教版低温诱导植物染色体数目变化实验提供改进措施。 主题词：人教版 低温诱导 多倍体  改进正文：对人教版低温诱导植物染色体数目变化实验的改进引言：多倍体植物具有很多优点，比如三倍体植物的不孕性，可降低植物生殖生长所需能量从而提高产量；还有多倍体植物基因剂量效应，使得多倍体植物具有较大的营养器官和生殖器官，也可提高产量等等。因此如何获得多倍体植物已成为农业技术中的焦点，同时也是难点。　　诱发多倍体的方法主要有物理法和化学法两种。物理的方法包括各种射线、异常温度、高速离心力、高温处理等。化学法是用秋水仙素、对二氯苯等化学药剂处理等。被广泛应用的主要是秋水仙素，成功率最高，经秋水仙素处理后，正处于有丝分裂的植物细胞，其纺锤体的产生受到抑制，这样染色体虽然进行了分裂，但细胞并未分开，因此，细胞内的染色体数成倍增加。此后，细胞再进行分裂就形成了多倍体。　　虽然秋水仙素被广泛使用，但如果应用于中学教学，秋水仙素属于有毒物品购买需向公安局备案，除此之外成本也较高，这个时候就必须选择其他的方法来诱导多倍体了，低温是个不错的选择。低温是物理因素，也能使微管解聚，即与秋水仙素有同样的作用。在动物（较低等）的多倍体诱导上已取得广泛成功，鲍鱼卵受精在3℃水温下可获三倍体；诱导率为70%。扇贝为78%，牡蛎低温诱导率是72%。虽然已在中国的帕米尔高原发现有大量的天然多倍体植物存在，但在植物的多倍体人工诱导方面则鲜有报道。故设计本实验对低温诱导能否使植物形成多倍体进行探究，旨在为低温诱导植物多倍体育种可行性提供科学依据。一. 材料与方法1实验材料1.1实验材料：大蒜（Allium sativum） （2n=16)，购于北京市延庆县恒生市场市场。人教版教材中选用的是洋葱，洋葱和大蒜都属于百合科葱属，并且大蒜个体小、出根多、好培养，因此选择大蒜替代洋葱。1.2实验试剂：0。1%秋水仙素、卡诺氏固定液（无水乙醇3份、冰乙酸1份混合即可）、解离液（ 95%乙醇3份、浓盐酸1份混合即可）改良品红。2实验方法本实验设置两个对照组：　　对照组一：用清水培养大蒜3-5天，待根长至约0。5厘米长后再在室温下连续培养72h，然后再放入4摄氏度的培养箱中24h作取材前处理。对照组二：用清水培养大蒜3-5天，待根长至约0。5厘米长时转入0。1%秋水仙素溶液中培养36h取出，再转入清水中继续培养48h，然后用0。1%秋水仙素溶液处理3h作取材前处理。2.2多倍体诱导用清水培养大蒜3-5天，待根长至约0.5厘米长时，分别放入0℃、2℃、4℃、8℃的培养箱中培养48h取材染色镜检。用清水培养大蒜3-5天，待根长至约0.5厘米长时，分别放入0℃、2℃、4℃、8℃的培养箱中培养72h，取出在室温下培养24h，然后再分别放入0℃、2℃、4℃、8℃的培养箱中培养24h，然后取材进行染色镜检。2.3生物学形态观察观察根尖形态是否发生变化，若发生变化及时记录变化情况。2.4染色体鉴定
2.4.1取材：剪取处理好的的根尖，长约5mm，3-5条(重复)。放入小瓶中用清水冲洗2~3遍。2.4.2固定：加入卡诺氏固定液于瓶中，加盖。固定时间以2h为宜。固定液应为材料的15倍体积以上。2.4.3解离：吸出固定液， 加入解离液。 在25℃下处理30分钟，然后吸去解离液，清水洗3次，洗去酸性解离液有利于下一步的染色。2.4.4染色：以浸染一下为好，加少许染液于瓶中，染15分钟以上。用镊子取根尖于玻片中央，滴半滴染液，盖上盖玻片。用带橡皮头的铅笔轻轻压敲，使根尖细胞分散成雾状。用吸水纸吸去多余染色液，以保洁净。在酒精灯火焰上过2-3次，以便分色。2.4.5镜检：经镜检挑选染色体分散良好分色清晰的细胞拍照留证。 二. 结果与分析1 染色体鉴定结果            

图三：0℃处理96h(2n=2x=16)　图四：8℃处理96h(2n=2x=16)　 

  

图六：对照二秋水仙素36h(2n>32)　图五：对照一清水(2n=2x=16)　    

         图七：2℃处理48h                      图八：2℃处理96h(2n=2x=16)　                          (2n=2x=32)　 

图十：4℃处理96h (2n=2x=32)　图九：4℃处理48h (2n=2x=16)　           
                                               

 从以上各图可看出，经过0℃、8℃处理96h的诱导株细胞和室温处理的对照株细胞的染色体数目均为2n=2x=16（见图三、四、五）。实验结果说明0℃处理和8℃处理诱导大蒜根形成多倍体的效果不明显或几乎无效。经过2℃和4℃处理48h的诱导株染色体数目均为2n=2x=16（见图七、图九），2℃和4℃处理96h的诱导株出现四倍体细胞，染色体数目为2n=4x=32（见图八、图十）。经过秋水仙素处理的对照株细胞有的染色体数目为2n=4x=32，还可观察到有的细胞染色体数目为2n=8x=64(见图六)。以上实验结果说明2℃和4℃处理96h能诱导大蒜根形成多倍体，和秋水仙素处理有类似的效果。三、讨论                 1. 对照组一的大蒜在室温下用清水培养，作为空白对照。新根形态正常，粗细均匀，取根尖分生区组织压片染色后，经镜检可见大蒜的二倍体细胞染色体数为2n = 2x =16。2. 对照组二的大蒜用秋水仙素培养，作为诱导出的多倍体对照。秋水仙素的水溶液直接作用于根尖生长点，可以获得较高的多倍体诱变率。形态学观察可见根尖明显膨大，这是由于染色体加倍使遗传物质增多，细胞体积也相应增大所致。取根尖分生区组织压片染色后，经镜检可发现许多诱导出的多倍体细胞，在本次实验中观察到处于有丝分裂前、中期的四倍体（2n =4x =32）和八倍体（2n = 8x =64）的细胞，八倍体细胞的产生是因为秋水仙素浓度低对细胞没有致死性，细胞还可以进行分裂，而且处理时间（36h）足够细胞连续分裂两次。3. 对大蒜进行0℃和8℃处理48h和96h，新根的外观形态与清水培养的对照组一相比较，并没有出现较明显的根尖膨大等现象，取根尖分生区组织进行压片染色后镜检也未发现多倍体细胞。该结果说明0℃和8℃的低温处理并不能诱导大蒜根形成多倍体，至少说明这样的处理诱导多倍体的效果并不明显。初步分析0℃处理下多倍体诱导效果不佳可能是由于温度过低，容易对植物机体造成伤害，植物可能更多的进行抗冻活动而不是进行细胞分裂生长；8℃的诱导效果不佳则可能是因为温度稍高，已超出能使微管解聚的作用温度范围。 对大蒜进行2℃和4℃的低温处理48h后，新根的外观形态与清水培养的对照组一相比较，并没有出现较明显的根尖膨大等现象，取根尖分生区组织进行压片染色后镜检也未发现多倍体细胞。该结果说明2℃和4℃的低温处理48h并不能诱导大蒜根形成多倍体，至少说明这样的处理诱导多倍体的效果并不明显。对大蒜进行2℃和4℃的低温处理96h后，新根的外观形态与清水培养的对照组一相比较，从外观形态上可见新根与室温下培养的对照组一的根尖相比出现明显膨大，而类似于用秋水仙素培养的对照组二（详见文中所附照片）；取根尖分生区组织压片染色后，经镜检发现处于有丝分裂前、中期的多倍体细胞，一般诱导出的是四倍体（2n = 4x = 32）。该实验的结果表明，经2℃和4℃的低温处理96h可以使大蒜新发的根诱导出多倍体，且效果较为明显。2℃和4℃低温处理能够诱导出多倍体，但以低温处理96h为宜，原因是低温能使微管解聚，细胞周期一般为10-30小时，但随温度而变，如豌豆根尖细胞在9℃时为55小时，30℃时为14小时。在本次试验中，2℃和4℃处理48h没有诱导出多倍体，可能是由于时间太短，细胞无法完成一次细胞周期，低温处理96h可明显看到诱导出多倍体。微管是细胞的有丝分裂中染色体的运动的动力源泉，微管的活动造成了染色体在有丝分裂后期的向两极的移动。低温引起了微管的解聚，从而使有丝分裂进入后期时染色体不能正常的被微管活动拉向两极，由此形成多倍体细胞。 经过一系列不同低温和处理时间实验的研究，并对不同的低温处理作了比较，我认为人教版教材中将《低温诱导植物染色体数目变化》实验作为学生实验是具有一定可行性的，但是的做出相应的改进。首先是实验材料，人教版教材中选用的是洋葱，本次试验选用的是大蒜。因洋葱和大蒜都属于百合科葱属，并且大蒜个体小、出根多、好培养，因此可选择大蒜替代洋葱。其次是实验处理，人教版教材中选取的是4℃低温处理36h，经过比较不同温度和处理时间的实验结果，我认为应该把实验处理改为2℃或者4℃低温诱导，低温处理的时间以96小时为最适。通过重复实验可以认为此处理具有可操作性和重复性，如果安排学生实验，只要教师做好实验处理，学生能够掌握植物染色体标本的制备技术，在显微镜下就很容易看到低温诱导植物染色体数目变化的现象。