偶看新闻食品推销产品对话:race 前人总结 引用
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/04/28 22:27:50
5’-RACE技术RNA聚合酶Ⅱ为例，启动子区一般位于转录起始位点上游200-300bp的范围内，也即转录起始位点的确定有助于分析基因的转录。而且有些基因具有多个转录起始位点，通过5’-RACE技术可以精确定位之，进而详细研究基因的调控机制。
5’-RACE试剂盒一般基于以下几种技术：SMART、Oligo capping method、self-ligation和anchored PCR。下面将分别介绍这些技术的原理和各自的优缺点。
1、SMART技术。该技术是基于以下两个观察发展起来的：a、不同反转录酶包括MMLV合成的cDNA 3’端保真度不高；b、不同的反转录酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端加上3-4个dCTP。该技术用MMLV合成cDNA第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA链3’加上3-4个dCTP，而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高（对全长分子的富集机制），随后这3-4个碱基与体系中事先加入的引物（该引物的3’端有3-4个dGTP）配对，MMLV继而以聚合酶活性将配对引物补成双链。目前基于该技术的试剂盒只有Clontech公司生产，全名为SMART RACE cDNA amplification kit（Cat634914）流程见图：
该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全场分子的比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。
2、Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。我们知道真核生物的mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增。降解的mRNA5’端都有一个磷酸基，用碱性磷酸酶去掉该磷酸基，随后用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则全长分子的5’端会暴露出磷酸基，随后的连接步骤中锚定引物将特意的加在全长分子的5’端而不会和降解的分子连接（全长分子的富集机制）。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产，步骤如图：
该方法的最大优点就是全长分子的比率高，可以说只要是扩增产物就肯定是全长分子。但是该方法的最大缺点是操作复杂，而且都是针对mRNA分子进行操作，使mRNA分子降解的风险极大提高，所以成功率不是很高。对于新手和实验室条件较差者不推荐使用该试剂盒。
3、Self-ligation技术。基因特异性（或者OligodT）反转录合成cDNA第一链，RNase H降解杂合链中的RNA，连接酶连接纯化后的cDNA链，在已知片段上设计反向PCR引物进行未知片段的扩增。该试剂盒宝生物以前有售，现在已停产，原理如图：
该试剂盒想法十分好，但是由于没有全长分子的富集机制，得到全长分子的几率比较低。而且在实际使用中它的扩增片段都比较短，不能满足实验要求。
4、Anchored PCR方法。利用一条基因特异性反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链，将RNA-DNA杂合链中的RNA降解纯化后，利用末端转移酶在cDNA链的3’端加入PolyC尾巴（尾巴长度不能确定），然后利用abridged anchored primer和一条基因特异性引物扩增（可能需要巢式PCR才能得到结果）。该试剂盒有Clontech（Marathon cDNA amplification, Cat: 634913）和Invitrogen（5’RACE system for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 18374-058）公司在售，操作简图如下：
该法最大的缺点是全长分子的比率较低，而且操作复杂，整个实验流程需要耗费超过一天的时间。这种方法没有像SMART和Oligo capping method中那样采取对完整分子的富集机制，所以它依赖于高质量的反转录酶（具有通读复杂二级结构的能力、具有较高的反应温度）和高质量的RNA，否则得到全长分子的几率会很低。的意义：可以精确定位转录起始位点。但是定位转录起始位点又有什么意义呢？以
好吧，最近一直头疼Race这伢，
网站，论坛，不少孩子都和我一样头疼，
也不少孩子已经拿到好的结果正得意的笑。
想去吸取个经验，
发现大家说的天差地别，
别人的难题搁我这儿，还OK，
可是我的难题，不知道在哪儿。
引用一点众说纷纭的东西：
“当时要克隆基因的5'GC含量达到了80%，一般的反转录酶和PCR都拿不到，后来加了海藻糖60度反转录一个小时后，用TaKaRa的GC-Buffer和LA-Taq才扩出来，当时就为了这个5端，很是费了力气。
如果RCR产物不是很特异或没有目的条带的话，建议用nest PCR。在做5‘时，对RNA要求比较高，最好用新鲜的组织提，随即做逆转录，扩增。
做RACE PCR条带单一的不多，尽可能的回收与目的片段大小相近的条带。克隆的时候，一般kit上建议挑8-10个克隆，多一个，多一份希望，因为RACE，尤其是5’太难了，我作了约6个月。
偶没有买试剂盒，自己合成了3条引物，买了反转录酶。然后一次就出来了。
我刚做过5’、3‘ RACE，我个人的经验如下：
1、首先，提的RNA必须完整，最好跑个RNA电泳来验证一下；
2、设计引物时要注意：Tm最好大于70度，两引物间要有100-200bp的重叠区；
3、用巢氏PCR相对容易出结果；
4、如果出现多个条带，要分别验证；
5、PCR过程中，我一般分两次，第一次用touchdowm PCR，后产物稀释50倍，作二次，72度尽量长一点，我们一般用2-3min；
6、结果分析，最好是重叠区吻合，否则，应重新做。
RACE是采用PCR技术由已知的部分cDNA顺序来扩增出完整的cDNA 3 '和5 '端的方法，又被称为单边PCR(one-sided PCR)和锚定PCR(anchored PCR)。
3'-RA CE的—般过程是：以oligo(dT)17和在许多文章中被称为锚引物(anchor primer)或接头(adaptor)的序列组成的引物QT逆转录mRNA得到第一条cDNA链，然后用含部分锚引物序列的引物Q0与基因特异性引物GSP1进行第一轮扩增得到双链cDNA ，第二轮扩增则采用内部引物(nested primer)Ql和GSP2，以防止产生非特异性扩增产物。
采用同样的原理可以进行5'-RACE,先用基因特异性引物GSP-RT逆转录mRNA 获得cDNA第一条链I。然后用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)和dATP在cDNA 5 '端加上poly(A)尾巴再使用(1)QT引物合成cDNA第二条链；(2)Qo和一个在GSP-RT上游的引物GSP1扩增cDNA,最后采用内部引物Q1和GSP2进行第二轮PCR扩增以提高特异性。
扩增后得到的双链cDNA用限制性内切酶酶切和Southern杂交分析并克隆，得到5'特异性和3’特异性的cDNA文库。从两个有相互重叠顺序的5'和3' RACE产物中可以获得全长cDNA，或者可以分析5 '和3 '端顺序，合成相应引物扩增出全长cDNA 。
建议你用clontech 的smart race试剂盒,我以前用的也是TAKARA的,结果做了N 次都没出来,换试剂盒后一次就做出来了.
SMARTTM 5‘-RACE的原理是先是利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5‘末端时自动加上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头(figure 2 )。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物，用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5‘末端的cDNA片段扩增出来。最终，从2个有相互重叠序列的3' / 5‘-RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3‘和5‘端序列，合成相应引物扩增出全长cDNA。目前基于该技术的试剂盒只有Clontech公司生产，全名为SMART RACE cDNA amplification kit（Cat634914）。该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全场分子的比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。
2、Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。我们知道真核生物的mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增。降解的mRNA5’端都有一个磷酸基，用碱性磷酸酶去掉该磷酸基，随后用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则全长分子的5’端会暴露出磷酸基，随后的连接步骤中锚定引物将特意的加在全长分子的5’端而不会和降解的分子连接（全长分子的富集机制）。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产，该方法的最大优点就是全长分子的比率高，可以说只要是扩增产物就肯定是全长分子。但是该方法的最大缺点是操作复杂，而且都是针对mRNA分子进行操作，使mRNA分子降解的风险极大提高，所以成功率不是很高。对于新手和实验室条件较差者不推荐使用该试剂盒。
3、Self-ligation技术。基因特异性（或者OligodT）反转录合成cDNA第一链，RNase H降解杂合链中的RNA，连接酶连接纯化后的cDNA链，在已知片段上设计反向PCR引物进行未知片段的扩增。该试剂盒宝生物以前有售，现在已停产。该试剂盒想法十分好，但是由于没有全长分子的富集机制，得到全长分子的几率比较低。而且在实际使用中它的扩增片段都比较短，不能满足实验要求。
4、Anchored PCR方法。利用一条基因特异性反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链，将RNA-DNA杂合链中的RNA降解纯化后，利用末端转移酶在cDNA链的3’端加入PolyC尾巴（尾巴长度不能确定），然后利用abridged anchored primer和一条基因特异性引物扩增（可能需要巢式PCR才能得到结果）。该试剂盒有Clontech（Marathon cDNA amplification, Cat: 634913）和Invitrogen（5’RACE system for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 18374-058）公司在售，该法最大的缺点是全长分子的比率较低，而且操作复杂，整个实验流程需要耗费超过一天的时间。这种方法没有像SMART和Oligo capping method中那样采取对完整分子的富集机制，所以它依赖于高质量的反转录酶（具有通读复杂二级结构的能力、具有较高的反应温度）和高质量的RNA，否则得到全长分子的几率会很低。”
这还只是其中一部分，
这么多这么多乱七八糟的建议里面，
最让我吐血的就是那句“对于新手和实验室条件较差者不推荐使用该试剂盒。”
这个就是本人正在用的 TaKaRa 5’-Full RACE kit…
做了两次，失败告终，试剂盒也用得差不多了，
我是新手，不推荐使用。
至于实验室条件，我问PP，咱算怎样，
她说，中等吧。
神哪，我总算不是两项皆out的那类人。
我是不推荐使用Takara试剂盒的新手，实验室条件中等…
昨晚上等老师一晚上，准备和他自首我目前的状态，结果他没来。
今天早上又开始望着他啥时候出现。
哎，Professor今天特低调，办公室门连个缝也没开，只有亮光能证明里面有人。
好吧，我去和professor自首说，试剂盒没了，东西没做出来。
老师说，5’是比较难做，这个是没有办法的，不行再买个试剂盒吧。
额，我想说，老师你太可爱了。谢谢你的支持。
最早开始买试剂盒的时候，也有考虑过Clontech的SMART RACE cDNA amplification kit。
因为大家都推荐这个，说什么好做。
然后打电话订的时候，那人和我说只有takara的，我还以为Clontech停产了，额…
好吧，然后就买了takara的5’-Full RACE kit，
很好，4K RMB，这年头被J消耗干了。
失败之后再去看smart race试剂盒，发现其实没有停产啊，只是好贵，9K RMB。
保全师兄建议我一种方法走到底，不要左摸索右分心，最后两头空空。
这话是有道理的，只是还是会心动smart race的便捷操作。
好吧好吧，其实自己还是有信心可以做好的，
既然是试剂盒，既然别人可以做出来，就不存在说有太大的问题，
自己好好做，再方方面面改进一下就OK了，
Smart race试剂盒简单在不需要对RNA进行预处理，降低样品损失的风险，
可是MS很多反馈意见说，smart race收不了尾，到不了5’末端。
额，这是个很麻烦的事情，要的就是5’末端，既然收不了尾，那还要试剂盒干吗？
Takara的5’-Full RACE kit，三步RNA预处理，然后富集全长mRNA分子，
成功则一步即可，失败则全盘皆输。好彻底。
颇有点，不鸣则已，一鸣惊人的感觉。
我觉得我会喜欢takara的这种感觉，
虽然前面的失败很难过，
整天顶着个浪费的帽子在头上，
但是，只要成功了，我第一步就算走完了。
先苦后甜嘛…
PS：J遵profess的意见，写了封电邮给profess当年，师姐将来的导师，Moriguchi sann，听听高手意见，再看，我们是smart还是takara吧。God bless me…
5’-RACE试剂盒一般基于以下几种技术：SMART、Oligo capping method、self-ligation和anchored PCR。下面将分别介绍这些技术的原理和各自的优缺点。
1、SMART技术。该技术是基于以下两个观察发展起来的：a、不同反转录酶包括MMLV合成的cDNA 3’端保真度不高；b、不同的反转录酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端加上3-4个dCTP。该技术用MMLV合成cDNA第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA链3’加上3-4个dCTP，而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高（对全长分子的富集机制），随后这3-4个碱基与体系中事先加入的引物（该引物的3’端有3-4个dGTP）配对，MMLV继而以聚合酶活性将配对引物补成双链。目前基于该技术的试剂盒只有Clontech公司生产，全名为SMART RACE cDNA amplification kit（Cat634914）流程见图：
该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全场分子的比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。
2、Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。我们知道真核生物的mRNA具有一个3’尾巴和一个5’帽子结构，该技术正是利用5’端的帽子特性对全长分子进行富集和扩增。降解的mRNA5’端都有一个磷酸基，用碱性磷酸酶去掉该磷酸基，随后用烟草酸性焦磷酸酶去掉帽子结构，则全长分子的5’端会暴露出磷酸基，随后的连接步骤中锚定引物将特意的加在全长分子的5’端而不会和降解的分子连接（全长分子的富集机制）。目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）两家都有生产，步骤如图：
该方法的最大优点就是全长分子的比率高，可以说只要是扩增产物就肯定是全长分子。但是该方法的最大缺点是操作复杂，而且都是针对mRNA分子进行操作，使mRNA分子降解的风险极大提高，所以成功率不是很高。对于新手和实验室条件较差者不推荐使用该试剂盒。
3、Self-ligation技术。基因特异性（或者OligodT）反转录合成cDNA第一链，RNase H降解杂合链中的RNA，连接酶连接纯化后的cDNA链，在已知片段上设计反向PCR引物进行未知片段的扩增。该试剂盒宝生物以前有售，现在已停产，原理如图：
该试剂盒想法十分好，但是由于没有全长分子的富集机制，得到全长分子的几率比较低。而且在实际使用中它的扩增片段都比较短，不能满足实验要求。
4、Anchored PCR方法。利用一条基因特异性反转录引物，在反转录酶的作用下合成cDNA第一链，将RNA-DNA杂合链中的RNA降解纯化后，利用末端转移酶在cDNA链的3’端加入PolyC尾巴（尾巴长度不能确定），然后利用abridged anchored primer和一条基因特异性引物扩增（可能需要巢式PCR才能得到结果）。该试剂盒有Clontech（Marathon cDNA amplification, Cat: 634913）和Invitrogen（5’RACE system for rapid amplification of cDNA ends, Cat: 18374-058）公司在售，操作简图如下：
该法最大的缺点是全长分子的比率较低，而且操作复杂，整个实验流程需要耗费超过一天的时间。这种方法没有像SMART和Oligo capping method中那样采取对完整分子的富集机制，所以它依赖于高质量的反转录酶（具有通读复杂二级结构的能力、具有较高的反应温度）和高质量的RNA，否则得到全长分子的几率会很低。
该技术用MMLV合成cDNA第一链，同时利用它的加尾特性在合成的cDNA链3’加上3-4个dCTP，而且当帽子结构存在时该酶的加尾活性最高（对全长分子的富集机制），随后这3-4个碱基与体系中事先加入的引物（该引物的3’端有3-4个dGTP）配对，MMLV继而以聚合酶活性将配对引物补成双链。
这样说，帽子结构对应的碱基序列会出现在cDNA中了吧。