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半胱氨酸蛋白酶抑制剂C （Cystatin C）
一、Cystatin C的生物学特征
1961 年Clausen 于脑脊液中发现一种物质,因它与哺乳动物胱蛋白A 和胱蛋白B 的结构及活性相似,当时被称为胱蛋白C 。1985 年cystatin C 首次被报道可作为评估GFR 的指标,称为半胱氨酸蛋白酶抑制剂C （中译文胱抑素C）。   
Cystatin C 是一种非糖基化的碱性蛋白质,由120 个氨基酸组成,相对分子质量是13. 36 ×103 ,等电点为9. 3 ,特点为位于羧基端附近有2 个二硫键。人的cystatin C基因片段位于20 号染色体上,其基因序列在大多数组织中能稳定表达。cystatin C是半胱氨酸蛋白酶抑制剂超家族2 中的一员。半胱氨酸蛋白酶包括木瓜蛋白酶家族中的组织蛋白酶(主要存在于溶酶体中) 和Ca2 + 激活蛋白酶家族中的Ca2 + 激活蛋白(主要存在于细胞质内) 。它们在细胞内肽类和蛋白质代谢特别是胶原代谢中起重要作用。这些肽切酶是肽键内切酶,其作用取决于酶活化位点上的氨基酸残端半胱氨酸的巯基。
半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一种限制性超家族蛋白质,分为三大超家族:超家族1 为the stefins ,包括胱蛋白A 和B 两个成员,主要分布在细胞内;超家族2 为半胱氨酸抑制剂家族,含有胱蛋白C、D、S、SV 和SA 五个成员;超家族3 为激肽原家族,含两个成员:低相对分子质量和高相对分子质量激肽原,主要分布在细胞外和血管内。通过基因结构和启动子研究,人体所有有核细胞均可产生cystatin C ,生成速度稳定、不受炎症、胆红素、溶血、甘油三酯的影响,且与性别、年龄、肌肉量无关。它主要分布于细胞外液,精液中浓度最高,其次,脑脊液浓度相对高于血中浓度,唾液、胸水中均含cystatin C;另外,某些细胞如神经细胞、甲状腺细胞、胰岛细胞内也有发现。相对分子质量低,等电点高,二者使cystatin C 能被肾小球自由滤过,然后在近曲小管上皮细胞内分解代谢,不被肾小管重吸收和分泌。
总之,cystatin C在体内的代谢特点: 肾脏是唯一的排泄器官，在近端肾小管上皮细胞被完全分解,不再重返血流，也不被肾小管上皮细胞分泌；能自由通过肾小球滤过膜；生成速度和血浓度稳定,不受其他病理变化影响。表明它是测定GFR 的一种理想指标。

二、　目前临床测定GFR常用指标的比较分析
目前,临床用来评价肾小球滤过功能的指标可分为外源性和内源性两大类。前者包括菊粉和一些放射性核物质,后者包括肌酐(Cr) 、尿素氮(BUN) 、尿酸(UA) 和β2 微球蛋白(β2-MG) 、视黄醇结合蛋白(RBP) 等低相对分子质量蛋白质。它们都有各自的局限性,现分述如下。
2. 1 　BUN（尿素氮） 　BUN 是蛋白质代谢产生的氨在肝脏经鸟氨酸循环生成的终产物,经肾小球滤过,大部分随尿排出,小部分被肾小管重吸收入血。由于肾脏代偿功能强,60 %～70 %肾单位功能受损时,BUN 才高于正常,敏感性差,所以,不能作为肾功能早期受损的指标。BUN 还受机体蛋白摄入量、分解水平、肾血流等因素影响,某些药物亦影响其测定值,氨基水杨酸、四环素、磺胺使之升高,VitC、左旋多巴、链霉素使之降低。
2. 2 　Cr（肌酐） 　Scr 是肌酸的代谢产物,经肾脏排泄,肾小管有少量分泌。GFR 下降至正常1P3 时,Scr 才明显上升。Scr 还受肌肉量、肉食摄入量及体内代谢水平的影响,儿童、老年人、消瘦者中,测值偏低,不能真实反映GFR。
Ccr 较BUN 和Scr 敏感,当Ccr 降至正常80 %以下,BUN和Scr 仍可在正常范围,但是同样也受多种因素的影响,并且测定技术操作繁琐,重复性差,误差大,不宜普查。
2. 3 　低相对分子质量蛋白质　β2-MG,RBP 等能反映早期肾功能变化,当GFR < 80mLPmin 时,β2-MG已升高。但易受病理状态影响,且血浓度不稳定,在感染、炎症、恶性肿瘤、肝病时,其生成速度加快,影响其真实性。
2. 4 　菊粉和放射性核素物质　菊粉和放射性核素物质,影响因素较少,被认为是测定GFR 的金指标。但是,菊粉清除率操作复杂,仅在实验研究中应用。测定放射性核素物质的清除率,价格昂贵,具放射性。某些患者如孕妇不适用,限制其临床应用。
总之,从临床应用角度出发,有必要寻找一种既符合评估清除率标记物特点,又经济适用,能在临床推广的物质来监测早期受损的肾功能,及时反映肾功能的变化,指导临床治疗。作为评估清除率的标记物应具以下特点: ①稳定的生成率。②稳定的血浓度,不受其他病理变化的影响,不与蛋白质结合。③肾小球自由滤过,不被重吸收或分泌。近年来,国外研究指出,半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C) 具有上述特点,是评估肾功能的一种敏感性好、特异性高的指标。

三、　Cystatin C的临床应用展望
Cystatin C在体内产生速率稳定,影响因素极少,是反映早期肾小球滤过功能受损的一个更理想、更可靠的指标,测定cystatin C来指导诊断及治疗,具有重大的临床意义。

1、血Cyst C 在评价肾功能中的应用
肾小球滤过率( GFR) 是评价肾功能的重要指标。通常采用各种外源性或内源性的标志物来测定GFR。外源性方法是通过连续或一次性静脉注射可在血浆和(或) 尿中测定其浓度的标志物来测定,这些物质包括菊粉、碘酞酸盐、对氨马尿酸、51铬2乙二胺四乙酸( 51Cr2EDTA) 、99锝2三胺五乙酸(99 Tc2DTPA ) 和碘酞六醇等,测定结果被认为是评价GFR 的金标准,但由于操作繁琐,不能作为常规检查。内源性的标志物包括肌酐、尿素和低分子量的蛋白质如β2－微球蛋白、α1－微球蛋白及视黄醇结合蛋白等。目前常规使用血肌酐和尿素氮水平及内生肌酐清除率(Ccr) 作为评估GFR 的参数,它们的测定方法相对固定,可迅速获取结果,但一些肾性和非肾性的因素可干扰这些结果, 如表所示 :　　（由于软件原因此处不能显示，详细请查阅附件，致歉）
Cyst C 的特点:分子量小,携带正电荷,可自由通透肾小球基底膜;被近曲小管重吸收及完全代谢,无肾小管的分泌;在组织中产生的速率恒定;排出只受肾小球滤过率的影响,而不受其他因素如性别、年龄、饮食、炎症、感染、血脂、肝脏疾病等的干扰。1985 年后,血浆或血清中Cyst C 的测定被逐渐用来作为GFR 的评估参数。随着检测方法的改进，血Cyst C 的测定被逐渐重视。大量研究证实Cyst C 是优于血肌酐(Scr) 的内源性标记物。Scr 是临床最常用的测定GFR 的指标,虽然与GFR 的相关性较差,在肾功能显著下降后才有升高,严格意义上只是一个衡量GFR 的粗浅指标,但其测定方法简便经济,被广泛采用。近年研究发现血清Cyst C 与GFR 的相关性较Scr 与GFR 的相关性更显著。表3 列举了不同作者在研究中得到的二者相关性的数值。
尽管相关系数( r) 是一个非常不敏感的指标,但上述不同样本中Cyst C 与GFR 的相关性均明显高于Scr与GFR 的相关性。有些作者使用敏感的ROC 曲线分析也得出相同结果。同时血Cyst C 判定肾功能减退的敏感性优于血肌酐。在206 例不同类型肾脏病患者
中采用Cr2EDTA 测定作为GFR 金标准,证实GFR下降时,血Cyst C 的升高发生早于Scr 的升高; Tian 等也发现在轻度GFR 减低的患者血Cyst C 的改变较血肌酐的改变出现迅速。最新Elisabeth 等研究51 例不同肾脏病导致的轻度肾功能损伤及10 例有高血压和少量蛋白尿但无肾功能不全证据的患者,用I2ICI 作为金标准测定GFR ,发现血Cyst C 的水平在肾功能下降至GFR 88ml/ min/ 1. 73 m2 时即明显升高,而血肌酐水平在GFR 下降至75ml/ min/ 1. 73 m2 时才开始升高;10 例患者虽然尚无肾损害的依据,但其Cyst C 的水平升高与对照亦有显著性差异。因此血Cyst C 是较血肌酐更敏感的诊断指标,尤其是在血肌酐的盲区。经研究发现，附表说明：
血清胱抑素C和血肌肝反映GFR的比较
GFR　　　　　　         血肌肝　　　　　      血cystatin C
89-71ml/min            全部正常　　　　　     45%-70%正常
70-61ml/min            50%左右正常            90%以上异常
61-51ml/min            24%左右正常            100%异常

2、在肾移植中的应用　
在肾移植术中,移植肾的GFR 可作为观察急、慢性排斥反应及免疫抑制剂的肾毒性指标之一,靠缓慢升高的Scr 来检测GFR ,不能及时、准确反映移植肾功能。因此,cystatin C可作为肾移植中肾功能的监测指标。

3、在糖尿病中的应用　
随着社会生活水平提高,糖尿病人数不断增加,1/3 患者发展为肾衰竭及需要肾透析。目前DN已成为全球范围内最常见的慢性肾功能不全的原因之一，所以,需要一个敏感、可靠的GFR 检测指标来评价糖尿病患者的肾功能。通过GFR 及微量白蛋白尿的评估可早期发现DM 患者的肾脏改变。虽然目前微量白蛋白尿在临床应用广泛,但昼夜排泄量不同,运动、尿路感染、高血压、心功能不全及急性发热均能影响其结果。更重要的是微量白蛋白尿是反映DN 发生的较晚期的标志,因此寻找DN 的早期标志物或DN 发生发展的筛查指标是目前临床重要课题。Mojiminyi 等认为,如果将微蛋白尿认为是检出糖尿病肾病的“金指标”,那么,与之相比,cystatin C 检出糖尿病肾病的灵敏度为40 % ,特异性为100 % 。所以,血cystatin C是一个比较敏感和实用的指标。在刚患糖尿病而无证据有肾病患者中,定期开展血清cystatin C检测以观察其与糖尿血管病变的关系,是必要的和可能的。

4、在高血压病中的应用
据估计，我国约有高血压患者超过一亿人，其中40%以上的高血压病患者到中、晚期可并发高血压肾病。据临床观察研究发现：高血压致肾损害分为三个阶段:其中第一阶段肾小球基本正常,肾内压增加；第二阶段肾小管高压性损伤(α-微球蛋白等)随后出现肾小球早期损伤, 血Cystatin C升高；第三阶段肾小球硬化,肾小管萎缩(主要为肾小球损伤的证据) Cystatin C升高。所以，临床定期监测高血压病患者的血清cystatin C水平对高血压病所导致的早期肾功能损伤的观察与早期预防、诊断和治疗具有很重要的临床意义。

5、尿cystatin C检测肾小管功能　
Cystatin C 是一种低相对分子质量蛋白质,肾小球自由滤过,然后在近曲小管上皮分解代谢而不是重吸收或分泌,不能用计算清除率的公式计算cystatin C清除率,但无论从理论上还是实践的临床研究发现来讲,尿cystatin C浓度应该可作为评价肾小管功能不全的指标之一。

6、Cyst C 在儿科疾病中的应用
在儿童中血肌酐的浓度是随着年龄的增长逐步上升的,直到成年才达到稳定,因此运用Scr 评定儿童肾功能有一定困难。近年来有学者在测定258 位没有肾脏疾病的正常儿童血Cyst C 时发现:出生后1～3 天内血Cyst C 的浓度非常高,可达1. 64～2. 59mg/ L ,在生后4 个月内迅速下降,1 岁左右其浓度逐渐稳定,大约是0. 7～1. 38mg/ L 。在69 例1～16 岁的儿童,以51Cr2EDTA 作为评定GFR 的金标准,Cyst C 与GFR 的相关性( r = 0. 83) 明显好于血肌酐与GFR 的相关性( r= 0. 67) 。Harmoinen 等报告的58 例早产儿、50 例足月儿及299 例生后8 天至16 岁的儿童测定Cyst C ,未发现性别差异;早产儿Cyst C 波动于1. 34～2. 57mg/L ,足月儿为1. 36～2. 23 mg/ L ;1 岁以内0. 75～1. 87mg/ L ,1～3 岁0. 68～1. 6 mg/ L ;作者发现3 岁以上儿童Cyst C 趋于稳定为0. 51～1. 31 mg/ L 。提示同成人相比血Cyst C 作为GFR 的衡量标准同样适用于儿童且有其独到之处。

7、Cyst C 与老年人
有关老年肾功能的报道甚少,但都提示60 岁以上的老年人GFR 减退,因老年人肌肉萎缩,肌组织减少,内源性肌酐产生减少,因此老年人的Scr 不能反映其GFR 的变化。研究发现50 岁以上老年人血循环中Cyst C 的水平逐渐上升。Fliser 等选取12 例血压正常的青年男性(平均年龄25 ±2 岁) 和41 例血压正常及增高的老年男性(平均年龄67 ±6 岁) ,菊粉清除率显示后者GFR 明显低于前者,二者的血肌酐水平无差异,而血Cyst C 水平老年组明显高于青年组,提示至少在肌酐水平为正常范围的老年病例中血Cyst C 是一个相当好的反映肾功能下降的指标 。

8、Cys C 在化疗中的应用
对化疗病人来说，很可能会导致肾功能的损害，因为化疗药物对肾小管有一定的损伤。 因此对进行化疗药物治疗的病人应及时关注其肾脏功能的状况，以适当调整药物剂量。 据报道，通过对接受顺氯氨柏(cisplatin) 进行化疗的肿瘤病人研究表明，Cys C 与GFR 的相关性比SCr 好(r = 0. 84 及r = 0. 74) 。 许多研究都比较一致地认为对化疗病人检测Cys C 比检测SCr 更有意义。      

9、血清胱抑素C与急性心衰
芬兰的教授最新研究表明,在急性心力衰竭的患者中,血Cystatin C对心衰患者预后的预测要高于其他指标(如:胆钠素,BNP,肌钙蛋白T) ，可以成为反映急性心力衰竭预后的一个敏感指标。该教授对622名有心衰老年人的研究中表明:血Cystatin C越高,死亡越高,将胱抑素C分为三个浓度组（附表说明）：

滴度急性心衰患者6个月的死亡率(%)
滴度1级3.2%
滴度2级15.1%
滴度3级25.9%

四、Cystatin C检测方法学的发展
Cys C 分子量较小，其测定方法主要基于免疫反应的原理。 Lofberg 等首先采用单向免疫扩散法(RID) 及酶免疫测定法对Cys C 进行检测，但从检验要求来看，这两种方法操作复杂，定量不准。此后，不断有较简单、灵敏的放射、荧光方法及各种酶免疫测定的方法(RIA、FIA、EIA) 报道. 但以上各种检测方法均属于非均相检测方法，定量重复性和稳定性不好。难以用自动化仪器检测，导致了Cys C 在临床诊断上难以被广泛应用。九十年代有关研究人员把检测方法选定在胶乳免疫测定上，胶乳免疫测定是一种均相测定方法，容易在自动化仪器上操作。 1994 年，Kyhse Andersen 等报道了一种颗粒增强透射免疫比浊法(PETIA) ，采用Cys C 特异抗体包被胶乳粒子作自动均相免疫分析，操作简单，检测速度快，使Cys C 检测可在自动生化分析仪上进行，为临床开展Cys C 检测提供了极大方便。