我不爱她林俊杰:肝癌相关标致物高尔基体蛋白GP73的基因序列的克隆、表达、抗体制备及初步应用

时间：2009-09-29  　作者：解放军三○二医院临检中心　李伯安 李波 刘爱霞 李永利 马洪滨 郭静霞 毛远丽  　来源：本站  　点击量：1019

          肝细胞癌（HCC）是世界上第五种最常见的癌症。2001年，全世界HCC的标化发病率为21/100,000，标化死亡率为20.2/100,000。我们可以看出，HCC的发病率和死亡率几乎是一样的，表明了这一肿瘤的预后是极差的。在2001年美国癌症状况国家年度报告中，HCC是过去十年中发病率增长最快的癌症^[2]。肝硬化是发展成为HCC的最重要的因素；因此肝硬化患者就成为了高危人群。预测，在美国接下来20年中，丙型肝炎（HCV）相关的HCC的发病率将会持续上升^[3]。考虑到美国肝硬化患者总体生存率的提高^[4]，和HCC患病率的持续增加，医学界就迫切需要一种早期HCC诊断的有效方法。开发出一种敏感度和特异度更高的血清标志物，用于危险人群的HCC早期诊断，就可能会提高这一致命癌症患者的生存率。

          目前，甲胎蛋白（AFP）是唯一的推荐用于肝硬化患者HCC监测的血清标志物。回顾性分析认为，AFP作为早期HCC监测工具，敏感度为39-64%，特异度为76-91%，阳性预测值为9-32%。另外，据报道，肝脏超声用于临床研究中早期HCC诊断时，具有78%的敏感度，91%的特异度，和73%的阳性预测值。然而，肝脏超声的准确性是操作者依赖性的，这就限制了它的价值，从而不能作为一种监测性检验方法。这说明，我们需要一种更好的用于HCC监测的标志物。

          高尔基蛋白-73（GP73），最初被认为是一种滞留性的高尔基体II型跨膜蛋白，主要在许多人体组织的上皮细胞中表达。在正常的人体肝脏中，GP73只在胆上皮细胞中表达，而肝细胞中则几乎检测不到表达。然而，临床发现，在患有病毒性或非病毒性肝病的患者的肝细胞中，GP73的表达出现显著的上调。一项最近的研究发现，可在人体血清中检测到GP73，而且，与非肿瘤肝脏相比，在HCC旱獭模型中，血清和组织中的GP73浓度都上升了。因此，GP73将成为HCC早期诊断的标志物。

          为了建立一个形式化的框架用于指导癌症生物标志物的评估和开发过程，美国国家癌症研究院的早期诊断研究网络采用了一个5期计划[12]。1期生物标志物开发研究的目的是（a）确定能否在肝病或非肝病患者血清中检测到GP73，（b）确定HCC患者血清中GP73浓度是否比肝硬化患者的更高，（c）比较GP73和AFP的在区分HCC与非肿瘤慢性肝病时所表现的性能特征。

          我们根据报道的GP73全基因序列设计、合成巢式PCR引物，从HepG2细胞中分离出GP73的基因片段。将该片段克隆到pET-28载体中，经过核苷酸序列测定证明该片段与报道序列的同源性为100％。将该重组载体转染至大肠杆菌BL21中，并诱导表达。经过蛋白电泳鉴定，重组体细菌裂解后可见外源基因表达带，与预期片段大小一致。

          细菌蛋白经纯化后，免疫新西兰白兔制备多抗，同时按常规方法免疫Bablc小鼠，建立杂交瘤细胞系，制备单抗。并应用饱和硫酸铵法纯化单抗。

          将上述制备的应用多抗纤维素DE52纯化后，采用改良过碘酸钠法，用辣根过氧化物酶（HRP）标记纯化的多抗。

          将纯化后的单抗按常规方法包被酶联板，按常规ELISA方法，分别加入肝癌患者血清温浴后，再加入酶标多抗温浴后，加入底物显色，建立血清了双抗体夹心ELISA检测GP73的方法，并证实单抗、多抗有共同的抗原结合位点。随后应用标准矩阵实验，确定ELISA实验中的最佳包被、血清稀释度及酶标抗体浓度确立ELISA检测方案。

          随后，根据上述最终确立的ELISA实验方案，对90例健康献血员，92例慢性肝炎患者及68例HCC患者血清进行了检测。结果显示在献血员、慢肝患者及HCC患者中GP73的阳性率分别为3.33％（3/90）、31.5％（29/92）、75.0％（51/68）统计分析表明各组间阳性率差异具有统计学意义。

          通过实验研究，我们获得了与报道序列同源性为100％的GP73基因片段，并通过克隆、表达、纯化获得了GP73的原核表达片段。随后我们通过免疫兔制备、纯化了多抗，并进一步免疫小鼠后建立了杂交瘤细胞系后制备并纯化了单克隆抗体。在标记了多抗后，我们建立了双抗体夹心检测GP73的ELISA方法。最后，我们检测了健康人群、慢肝及肝癌患者血清中的GP73，发现各组间阳性率差异显著。我们的研究为进一步确定对GP73在HCC早期诊断中意义，奠定了基础。下一步我们将建立糖基化GP73的检测方法（根据报道该异质体与肝癌的相关性更显著），并进一步进行病理学及大规模的流行病学调查以确立GP73及糖基化的GP73在HCC早期诊断中的作用。