洋丰复合肥怎么样:小鼠胰岛的分离纯化及体外功能检测的实验研究

来源：中国论文下载中心    [ 08-07-14 11:14:00 ]    编辑：studa20
1.3　统计学处理　应用Excel软件t检验统计学方法进行处理，P≤0.05为差异有统计学意义。
作者：宋科瑛　王瑞涛　卢列盛　董维平　李克
【摘要】  　　目的：探讨获得高质量小鼠胰岛的分离纯化方法，评价其功能。方法：采用胆总管内胶原酶灌注膨胀消化胰腺的方法分离小鼠胰岛，不连续密度梯度离心法纯化胰岛，用双硫腙（Dithizone，DTZ）对胰岛进行特异性染色计算胰岛产量及纯度，以葡萄糖和茶碱刺激胰岛素释放检测胰岛功能。结果：胰岛的产量和活性主要与胰腺均匀膨胀和胶原酶的消化时间有关。平均每个小鼠胰腺能得到150~250个高质量胰岛，活性>95%，纯度>90%。葡萄糖及茶碱（carbachol， Cch）刺激后胰岛素释放量明显增加。结论：改良的胆总管内胶原酶灌注膨胀消化小鼠胰腺及不连续密度梯度Ficoll-400纯化胰岛的方法，可获得产量较高、纯度及功能较好的胰岛。
【关键词】  胰岛·分离·纯化·小鼠
Isolation， Purification and Functional Assessment of Islets in Mice
【ABSTRACT】 Objective: The technical difficulty in mouse islets isolation and purification restricts its wide use in diabetes and islet transplantation field. Here we reported and discussed a modified method with which to isolate and purify high quality islets in mice. Methods: Intraductal collagenase-P perfusion and uniform distention of the gland were applied to digest mice pancreas. A Ficoll gradient solution（25%, 23%, 20%, and 11%） was applied to make the purification. Islets were then tested for their specificity by Dithiozine（DTZ） staining. The islet function was assessed by the glucose- and carbachol-stimulated insulin secretion test. Results: The yield and viability of the islets were closely associated with good gland distention and collagenase digestion timing. We used the method discussed here, each mouse pancreas could yield 150~250 islets, with viability >95% and purity >90%. The insulin release from the in vitro islets fed with high concentration glucose and Carbachol stimuli raised to a significantly higher level. Conclusion: The above-mentioned method of mice isolation and purification might yield high quality islets for further scientific use.
【KEY WORDS】 Islets· Isolation·Purification· Mice
胰岛移植被认为是有望治愈胰岛素依赖性糖尿病（insulin-dependent diabetes mellitus）的新型治疗方法。小鼠品系纯正，可重复性好，可进行基因调控,自身繁殖力强，可缩短科研周期，已在国外胰岛移植和糖尿病研究领域，尤其是基因治疗领域，得到越来越广泛的应用［１-５］。但由于小鼠体积小，胰腺相关解剖结构细微，胰岛的分离纯化操作有一定的难度。本研究参考学术交流中获得的纽约西奈山医学院和美国康奈尔大学医学院的小鼠胰岛分离纯化方案，结合国内实验条件，对小鼠胰岛的分离、纯化、培养作了改进。体外功能检测证实，该方法分离纯化的小鼠胰岛可用于胰岛移植的相关后续研究。
1　材料与方法
1.1　材料　8~12周龄的雄性C57BL/6小鼠，购自中国科学院上海实验动物中心,在清洁环境下喂养。Nagashima No. 5304 型手术显微镜由日本永岛医疗器械株式会社制造。胶原酶-P为Roche公司产品，Ficoll-400 为Pharmacia公司产品,超灵敏胰岛素ELISA试剂盒购自Crystal Chemical公司，DNA酶Ⅰ购自Sigma公司，RPMI 1640培养基、小牛血清和胎牛血清由GIBCO公司提供。
1.2　方法
1.2.1　分离液和消化液的配制　分离液（dissociation buffer）的配制： Hanks液500 ml加入50 mg DNA 酶Ⅰ和12.5 ml、1 mol/L 羟乙基哌嗪乙磺酸（hydroxyethyl  piperazine ethanesulfonic acid, HEPES）， 0.22 μm孔径滤膜过滤，调节pH值至7.2~7.4， 4 ℃ 保存。消化液的配置临用时新鲜配置，采用分离液溶解胶原酶-P，浓度为1 mg/ml。
1.2.2　Ficoll-400浓度梯度溶液的配制　 Ficoll-400 108 g，加324 ml分离液，配成25% Ficoll-400溶液；充分混匀后量取25% Ficoll-400溶液 91.20 ml用分离液定容到100 ml，配成23% Ficoll-400溶液；取23% Ficoll-400溶液 80.52 ml分离液定容到100 ml，配成20% Ficoll-400溶液；取20% Ficoll-400 44.12 ml用分离液定容到100 ml，配成11% Ficoll-400溶液。全部配制完成后0.22 μm孔径滤膜过滤，液体pH值均调至7.2~7.4， 4 ℃ 保存。
1.2.3　小鼠胰岛的分离　1%戊巴比妥钠按照40 mg/ｋg 剂量对小鼠行腹腔注射麻醉。75%乙醇消毒皮肤，打开腹腔，肝脏外展暴露胰腺及胆总管，在胆总管进入十二指肠处将其夹闭。按每个胰腺5 ml 配制胶原酶-P溶液（1 g/L，4 ℃），置于50 ml离心试管中备用。体视显微镜下采用30 G规格针头穿刺胆总管，缓慢注入胶原酶-P溶液2~3 ml，使溶液逆行进入胰腺导管，均匀膨胀胰腺。剪心放血处死小鼠。剪除胃与横结肠之间的大网膜及脾脏，沿十二指肠边缘自十二指肠向小肠方向剥离胰腺组织。剩余部分沿胰腺边缘完整取出，所取组织置于备好的50 ml离心试管中，4 ℃保存。37 ℃水浴静止消化10~20 min，振荡使其呈细砂状，加入4 ℃含10％小牛血清的Hanks液至50 ml，终止消化，35目不锈钢滤网（孔径400 μm）过滤，1 000 r/min离心2 min，弃去上清，4 ℃、1%小牛血清的 Hanks 液清洗离心 2 遍，收集沉淀。
1.2.4　胰岛的纯化　将分离的胰腺组织沉淀混悬于10 ml、25%的Ficoll-400溶液中，依次加入23%、20%和11%的Ficoll-400溶液各5 ml，1 500 r/min 水平离心20 min（或1 800 r/min水平离心15 min），采用5 ml一次性吸管收集20%~11% 界面上的细胞层，此层一般含有大量的胰岛；同时保留23%~20% 界面细胞层（在胰腺组织消化不完全的情况下，胰岛可能存留于该层面，可在确认胰岛存在20%~11%界面后弃置）。含10%小牛血清Hanks液洗涤1次， 1%小牛血清Hanks液洗涤2次。每次洗涤后1 000 r/min离心1 min保留沉淀。沉淀悬浮于六孔板中，倒置显微镜下观察胰岛的产量及质量。10 μl移液器吸取形态完整的胰岛至另外的含10% 胎牛血清的RPMI 1640培养基的孔中，置于37 ℃、 5% CO2培养箱中过夜培养，备试验。
1.2.5　胰岛活性鉴定和特异性染色　以台盼蓝染色判断胰岛细胞活性，死亡细胞被染成蓝色，而活细胞不着色。用双硫腙（dithizone, DTZ）对胰岛细胞进行特异性染色，倒置显微镜下胰岛细胞为猩红色，非胰岛细胞不着色，计算胰岛产量及纯度（计数视野内染色细胞团的数目及未染色细胞团数目）。
1.2.6　体外胰岛素释放实验　新鲜游离的胰岛经过夜培养短暂的自我修复后应用于本研究。实验前，所有胰岛均在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育60 min，使胰岛适应实验用培养基的改变。显微镜下仔细选取包膜完整、形态正常的胰岛用于功能检测。24孔培养板中每孔加入 1 ml RPMI 1640 培养液、10个胰岛和不同浓度的葡萄糖和茶碱，分为低糖（葡萄糖3 mmol/L）、高糖（葡萄糖20 mmol/L），低糖茶碱（葡萄糖3 mmol/L加茶碱10 mmol/L），高糖茶碱（葡萄糖10 mmol/L加茶碱10 mmol/L）4组，每组至少4孔。作用60 min后吸取上清检测胰岛素水平。
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2　结果
分离纯化的小鼠胰岛杂质少，外膜完整，形态正常。倒置显微镜下观察，胰岛细胞团呈圆形或卵圆形，大小不一（图1）。台盼蓝染色显示，细胞存活率>95%。DTZ染色显示绝大部分细胞呈特征性红染，获取的胰岛纯度>90%，每个小鼠的胰腺可以获得400个左右胰岛，其中150~250个高质量的胰岛可用于体外功能检测实验。
体外胰岛素释放实验结果显示， 低糖组胰岛素释放量为（0.435±0.175）ng/islet， 高糖组胰岛素释放量明显增加，达到（1.866±0.321）ng/islet；茶碱能够增强胰岛素释放，低糖茶碱组胰岛素释放量为（0.880±0.150）ng/islet， 高糖茶碱组胰岛素释放量达到（2.728±1.399）ng/islet。4组间两两比较，差异均有统计学意义，P<0.01（图2）。
3　讨论
胰岛移植是一种治疗胰岛素依赖型糖尿病的新型手段，胰岛的体外分离、纯化培养是有效治疗的前提和关键。标准组织切碎消化技术（切碎法）在1965年由Moskalevski首创，随后被Lacy和Kostianovsky改良［6］。但是此方法很大程度上依赖操作技术，缺乏一致性，而且对胰岛的破坏较大。据文献报道，应用切碎法，供体胰腺中至多保留50%的胰岛［7］。1996年，Shapiro提出了一种改良型静止消化技术，并将其与标准化组织切碎消化技术进行了严格的双盲比较，结果显示胆总管内胶原酶注射静止法胰岛产量高出切碎法47.5%，且胰岛功能保留方面亦优于切碎法［8］。
随着分离纯化技术不断成熟，胰岛移植实验研究及临床应用得到了飞速发展，然而胰岛移植疗效并不十分满意。除了与移植后诱发免疫排斥反应和免疫抑制剂损伤有关外，移植前的体外培养、移植后微环境改变以及炎症因子的释放等均能促进移植的胰岛细胞凋亡。基因治疗技术发展使基因治疗改良胰岛移植受到广泛关注。胰岛移植作为一种组织移植，可以安全方便地在体外进行基因修饰，从而降低免疫排斥，提高移植胰岛的存活率，减少细胞凋亡。
制作转基因和基因敲除小鼠已经成为成熟的技术，在移植免疫领域的基因治疗方面有广泛的应用。然而由于小鼠体积小，胰腺及导管系统细微，胰岛的提取需要在解剖显微镜下进行精细操作，限制了其在实验研究的应用。
胆总管穿刺灌注使小鼠胰腺完全充分扩张是获得高质量胰岛的关键，实验发现未扩张的胰腺组织中分离胰岛的产量明显减少。操作过程应轻柔，防止胆总管痉挛。有学者提出从小鼠胆囊穿刺灌注［9］，但因为小鼠胆道系统变异较多，有时胆囊管开口较低，夹闭胆总管时可能同时夹闭胆囊管开口，胶原酶溶液无法逆行至胰腺；小鼠胆囊颈较为狭窄弯曲，灌注时无法达到有效的压力，胰腺充盈并不理想。分离胰腺时，预先将脂肪杂质多的网膜组织弃除，完整剥离胰腺也是提高胰岛产量和质量的重要步骤。
选择合适的酶浓度并控制消化时间非常重要。由于实验室实验条件不同、实验动物的个体差异和胶原酶类型的不同，最佳消化时间也不相同。消化时间过短，胰岛未能从外分泌腺泡中释放出来；消化时间过长，胰岛易破碎，活性受损，且常形成一种黏稠的胶状物（主要是脂肪组织所致），影响胰岛分离。本实验采用Roche公司生产的胶原酶-P，在1 mg/ml浓度下，消化10~20 min能获得最大产量且纯度高的胰岛。
纯化过程中的每一步预先用含血清的培养液湿润瓶壁，可以有效的防止胰岛贴壁，增加最终的胰岛产量。经清洗纯化后，虽然可以直接采用11%~20%界面细胞层作为胰岛进行培养，但是此层内仍然存在部分外分泌腺细胞，外分泌腺的消化作用对胰岛的消化损伤较重。为此推荐使用移液器再次手工挑拣的方法，由此获得的胰岛外膜完整，边界光滑，结构致密，产量也较多。用移液器挑选胰岛时先用10%小牛血清湿润一下枪头，以减少胰岛附着和损伤。
经体外功能测定，本实验方法纯化分离的小鼠胰岛，能够感受葡萄糖浓度的变化和茶碱的刺激，调整胰岛素的释放，接近正常胰岛功能，完全可以用于后续实验。
【参考文献】
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