意中人英文:组织培养

植物的组织培养，即植物无菌培养技术，是利用植物体离体器官、组织或细胞具有的再生能力，在无菌适宜的人工培养基及光、温度等条件下进行人工培养，使其增殖、生长、发育而形成完整的植株，是植物细胞具有全能性的表现。它是现代最先进的植物繁殖技术，现在我国的花卉工作者，已利用这种方法繁殖出木本、草本、蕨类、仙人掌及多肉植物等许多花卉的优良品种。
组织培养工作应在室内无菌条件下进行，培养的离体材料称为外植体。组织培养根据外植体的不同，可分为胚胎培养、器官培养、组织培养（含愈伤组织）、细胞培养、原生质体培养和细胞杂交等。根据培养的操作方式不同，又可分为固体培养和液体培养。液体培养又有振荡培养、旋转培养和静止培养等。
组织培养的应用
一、快速、大量繁殖优良品种
组织培养与传统的无性繁殖相比，工作不受季节限制，而且经过组织培养进行无性繁殖，具有用材少、速度快等特点。组织培养虽然有用材少、增殖率高的优点，但成本较高，一般在母株材料少而需短时期内大量增殖和培育脱毒苗时才应用，如母株材料多且没有褪化时，还是以传统繁殖方法为宜。
二、在花卉育种上和利用
在花卉育种上，应用很广泛，主要在胚胎培养、单倍体育种、体细胞杂交和植物基因工程等方面应用较多。通过组织培养，可缩短育种年限和世代，也有利于基因突变中隐性突变的分离。
三、花卉的提纯复壮
运用组织培养，苗木的复壮过程很明显，对于长期运用无性方法繁殖并开始退化的花卉品种，如康乃馨可采用组培方法繁殖，可使个体发育向年青阶段转化。
四、获得无病植株
一些用无性繁殖方法来繁衍的花卉种类，如康乃馨、菊花、郁金香、水仙、百合、鸢尾等，不能通过种子途径去除病毒。由于利用植物体的一部分繁殖，易导致病毒积累，危害加重，影响了花卉的观赏效果。而植物在茎尖生长点区几乎不含或含极少病毒，因为该区无维管束，病毒难以进入，所以茎尖培养成为获得无病毒植株的重要途径。
五、种质资源的保存
很多无性繁殖的植物因没有种子供长期保存，其种质资源传统上只能在田间种植保存，耗费人力物力，且资源易受人为因素和环境因素而丢失。而用组培方法，可大大节省人力、物力，大大延长保存期。
组织培养条件
一、实验室
组织培养是在无菌条件下进行，需要一定的实验室条件，应具备：
（一）化学试验室
用于存放各类化学药品，配制培养基等。需要的物品有：
⒈药品柜　存放化学药品。
⒉玻璃器皿柜　存放各类玻璃器皿。
⒊试验台　分别用来安放天平和配制培养基。
⒋冰箱　存放配好的母液和一些需低温保存的药品及植物材料等。
⒌其它　天平、水浴锅、酸度计、水池等。
（二）洗涤消毒室
用作器皿的洗刷、消毒、干燥等，配有高压灭菌锅、烘箱、铁架、水池等，也可与化学实验室合并。
（三）无菌操作室
用于植物材料的消毒、接种、转移、原生质体制备等。要求室内封闭，保持无菌。并具备以下物品：
⒈超净工作台　用于消毒、接种、转移培养材料。
⒉紫外灯　用于空气消毒。
⒊解剖镜　用于胚胎培养、茎尖培养时剥取外植体。
⒋低速离心机　用于原生质体制备。
（四）培养室
是供培养物生长的场所，主要有培养架、控温、控光设备等。培养架可分4－5层，上面安装30－40Ｗ日光灯照明，每天照明10－16小时左右，用自动定时器控制。温度最好保持在15－25℃左右。此外还可根据需要安置液体培养所需的摇床、转床等。
二、常用药品
组织培养所需药品主要用于培养基的配制，也有部分用于消毒，主要有以下几类：
（一）消毒药品
主要有次氯酸钠、次氯酸钙、双氧水、漂白精片、溴水、硝酸银等。
（二）无机盐类
包括大量元素和微量元素两类，主要的盐类有KNO3、MgSO4·7H2O、NH4NO3、KH2PO4、CaCl2·2H2O、Fe2（SO4）3、Na2HPO4、CuSO4、NaNO3、Na2SO4、ZnSO4、MnSO4·4H2O、MnCl2·2H20、KI、H3BO3等，无机盐是供外植体吸收的基本营养成分，各有不同作用，如N、P影响蛋白质的合成，Ca、K、S、Mg影响酶活性等。
（三）有机化合物
主要有蔗糖、维生素类、氨基酸等。其中蔗糖是不可缺少的碳源，也是渗透压调节物质。维生素的主要作用是促进细胞分裂和诱导器官分化。氨基酸是蛋白质组成成分，也是有机氮源。
（四）植物生长调节剂
用于组织培养的主要有生长素、细胞分裂素及赤霉素三大类：
⒈生长素类　主要有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4－D和吲哚丁酸（IBA）。2，4－D有利愈伤组织生长，NAA、IAA、IBA有利于器官分化。
⒉细胞分裂素类　主要有激动素（KT）、6－苄基腺嘌呤（BA）、玉米素（ZT）等。其作用是促进细胞分裂与分化，其中KT能明显促进芽的分化而抑制根的形成。
⒊赤霉素　以GA3运用最广泛，有促进不定芽和幼株伸长的作用。
（五）有机附加物
包括人工合成和天然的有机物，常用的有酵母提取物、椰乳、果汁等及相应的植物组织浸出液。对细胞和组织的增殖和分化有一定促进作用。此外琼脂在组培中作为凝固剂，是外植体的支持体，常用浓度为0.5－1％。
（六）水
培养基用水原则上使用蒸馏水，去离子水等，尤其在对化学成分要求较精确的试验中。但在组培苗的批量生产中，可选用自来水配制，以降低成本。
培养基的配制
根据培养基的物理性状大致分为两类，即固体培养基和液体培养基。在培养基中加入一定量的凝固剂（如琼脂、明胶等）即为固体培养基，而不加入凝固剂的即为液体培养基，具体运用上应视培养目的要求不同分别选择采用。
无论是固体还是液体培养基，其基本成分是类似的，即基本培养基如MS、B5、N6等和附加成分如激动素和天然附加物等。用于组织培养的培养基主要有以下几种：
一、MS、B5、N6培养基组成和配方（见表6－1、6－2、6－3）。
表6－1　MS培养基的组成配方
组成成分
数量(mg/l)
组成成分
数量(mg/l)
NH4NO3
1650
Na2-EDTA
37.3
KNO3
1900
FeSO4·7H2O
27.8
CaCl2·2H2O
440
CuSO4·5H2O
0.025
MgSO4·7H2O
370
蔗糖
30
KH2PO4
170
pH
5.8
KI
0.83
肌醇
100.0
H3BO3
6.2
烟酸
0.5
MnSO4·4H2O
22.3
盐酸吡哆醇
0.5
ZnSO4·7H2O
8.6
甘氨酸
2.0
Na2MoO4·2H2O
0.25
盐酸硫铵等
0.4
CoCl2·6H2O
0.025
表6－2　B5培养基的组成和配方
组成成分
数量(mg/l）
组成成分
数量(mg/l)
KNO3
2500
FeSO4·7H2O
27.8
CaCl2·2H2O
150
CuSO4·5H2O
0.025
MgSO4·7H2O
250
蔗糖
40
(NH4)2SO4
134
pH
5.5
KI
0.75
肌醇
100
H3BO4
3.0
烟酸
1.0
MnSO4·4H2O
10
盐酸吡哆醇
1.0
ZnSO4·7H2O
2.0
激动素
0.1
Na2MoO4·2H2O
0.25
2,4－D
0.1－1.0
CoCl2·6H2O
0.025
盐酸硫铵
10
Na2-EDTA
37.3
二、培养基的配制
（一）母液的配制与保存
由于组培的植物不同，需要配制不同的培养基，为减少工件量，可把药品配成浓缩液，一般为10－100倍，其中大量元素倍数略低，一般为10－20倍，微量元素和有机成分等一般为50－100倍，母液的配制及保存应注意以下几个方面：
⒈药品称量应准确，尤其微量元素化合物应精确到0.0001克，大量元素可精确到0.01克。
⒉配制母液的浓度适当，一是长时间保存后易沉淀，二是浓度大，用量少，在配制培养基时易影响精确度。
⒊母液贮藏不宜过长，一般几个月左右，要定期检查，如出现浑浊、沉淀及霉菌等现象，就不能使用。
⒋母液应放在2－4℃的冰箱中保存。
表6－3 N6培养基的组成和配方
组成成分
数量(mg/l)
组成成分
(mg/l)
KNO3
2.3
Na2－EDTA
37.3
CaCl2·2H2O
166
FeSO4·7H2O
27.8
MgSO4·7H2O
185
蔗糖
50
KH2PO4
400
pH
5.8
(NH4)2SO4
463
烟酸
0.5
KI
0.8
盐酸吡哆醇
0.5
H3BO3
1.6
甘氨酸
2.0
MnSO4·4H2O
4.4
盐酸硫铵
1.0
ZnSO4·7H2O
1.5
（二）培养基的配制
根据培养基配方，算好母液吸取量，并按顺序吸取，然后加入蔗糖溶液，并加入蒸馏水定容，并用0.1－1mol/l的HCl或NaOH调整pH值，加入琼脂加热熔化，配制好的培养基要趁热分注，倒入三角瓶等培养器皿中，封口准备消毒。
（三）培养基的消毒
由于培养基内有丰富的营养物质，极利细菌和真菌繁殖，造成污染，影响组培的成功，一般有高温高压消毒和过滤消毒两种方法。
⒈高温高压消毒　一般用消毒锅消毒，注意消毒锅不能装的过满，锅内保持1.1Kg/cm2的压力,温度120℃左右，大约15－20分钟即可。
⒉过滤消毒　一些易受高温破坏的培养基成分如IAA、IBA、ZT等，不宜用高温高压法消毒，可用过滤消毒，可过滤消毒后再加入已高温高压消毒的培养基中，过滤消毒应在无菌室或超净工件台上进行，以避免污染培养基。
组织培养的方法和步骤
一、培养材料的采集
组织培养所用的材料非常广泛，可采取根、茎、叶、花、芽和种子的子叶，有时也利用花粉粒和花药，其中根尖不易灭菌，一般很少采用。
对于木本花卉来说，阔叶树可在一、二年生的枝条上采集，针叶树种多采种子内的子叶或胚轴，草本植物多采集茎尖。
在快速繁殖中，最常用的培养材料是茎尖，通常切块在0.5厘米左右，如果为培养无病毒苗而采用的培养材料通常仅取茎尖的分生组织部分，其长度在0.1毫米以下。
二、培养材料的消毒
（一）先将材料用流水冲洗干净，最后一遍用蒸馏水冲洗，再用无菌纱布或吸水纸将材料上的水分吸干，并用消毒刀片切成小块。
（二）在无菌坏境中将材料放入70％洒精中浸泡30－60秒。
（三）再将材料移入漂白粉的饱和液或0.01％升汞水中消毒10分钟。
（四）取出后用无菌水冲洗三、四次。
三、制备外植体
将已消毒的材料，用无菌刀、剪、镊等，在无菌的环境下，剥去芽的鳞片、嫩枝的外皮和种皮胚乳等，叶片则不需剥皮。然后切成0.2－0.5厘米厚的小片，这就是外植体。在操作中严禁用手触动材料。
四、接种和培养
（一）接种
在无菌坏境下，将切好的外植体立即接在培养基上，每瓶接种4－10个。
（二）封口
接种后，瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口。
（三）温度
培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位的不同而区别对待。
（四）增殖
外植体的增殖是组培的关键阶段，在新梢等形成后为了扩大繁殖系数，需要继代培养。把材料分株或切段转入增殖培养基中，增殖培养基一般在分化培养基上加以改良，以利于增殖率的提高。增殖1个月左右后，可视情况进行再增殖。
（五）根的诱导
继代培养形成的不定芽和侧芽等一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养。1个月后即可获得键壮根系。
五、组培苗的练苗移栽
试管苗从无菌到光、温、湿稳定的环境进入自然环境，必须进行炼苗。一般移植前，先将培养容器打开，于室内自然光照下放3天，然后取出小苗，用自来水把根系上的营养基冲洗干净，再栽入已准备好的基质中，基质使用前最好消毒。移栽前要适当遮荫，加强水分管理，保持较高的空气湿度（相对湿度98％左右），但基质不宜过湿，以防烂苗。