11. 如何确定需要合成多少OD值的引物？

根据实验目的确定。一般PCR扩增，20个碱基左右引物2 OD，可以做400次50 μl标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。

12. 如何测定引物的OD值？

合成引物的OD值是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260 nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1 ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。例如，验证2 OD引物量是否准确，简单的做法是：加入1 ml水，彻底溶解混匀后，取100 μl, 加入900 μl水，用光径为1 cm的石英比色杯，波长260 nm，此时光吸收的读数为0.2。

13. 如何通过OD值计算引物的浓度？

金斯瑞的合成报告单和引物标签上都会标识OD值与摩尔量。引物保存在高浓度的状况下比较稳定。溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD值是否一致。如果不一致，请及时和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。

根据国际统一标准: 1OD引物干粉约为33微克； 引物的摩尔数(μmol) =质量数 / 引物分子量 =(OD数×33)/引物分子量

如您拿到1管2 OD的引物, 分子量是6565.3 引物的摩尔数(μmol) =（2×33）/6565.3 ≈0.010μmol=10 nmol

若您需要溶解为10μM (=10pmol/μl)的溶液，只需加入1 ml无菌ddH₂O或10 mM pH7.5 TE缓冲液充分溶解即可。

14. 引物（含修饰）的分子量是如何确定的？

南京金斯瑞生物科技有限公司所提供的Oligo分子量均按照精确算法进行计算。

分子量计算公式：MW= A×313.21 + G×329.21 + C×289.18 + T×304.2 + M×301.2 +R×321.21 + W×308.71 + S×309.2 +Y×296.69 + K×316.71 + V×310.53 + H×302.2 + D×315.54 + B×307.53 + N×308.95 +16×Ns + 修饰基团分子量 - 61.96

公式中Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16，其余字母均代表相应碱基的个数。兼并碱基分子量取相应碱基分子量的平均值，如M=A/C=(313.21+289.18)/2 常用的兼并碱基代码：M=A/C R=A/G W=A/T S=G/C Y=C/T K=G/T V=A/G/C H=A/C/T D=A/G/T B=G/C/T N=A/G/C/T

15. 如何保存引物？

引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。没有溶解的引物非常稳定，-20 ℃下可保存2-3年，甚至更长。溶解后的引物-20 ℃下避免反复冻融，可以保存至少半年以上。如果对实验的重复性要求较高，合成的OD值较大，建议将溶解好的引物事先稀释为100 μmol/L的储存液，分装数份保存于-20 ℃冰箱。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10 pmol/ml或20 pmol/ml）后进行实验。修饰荧光引物需要避光保存。

16. 引物在常温下运输，会降解吗？

不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通常都在1-3天，所以您收到的引物不会降解。

17. 如何溶解引物？

干燥后的引物质地非常疏松，开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟 的转速下离心1分钟，或管垂直向上在桌面上轻敲几次，将引物粉末收集到管底，防止开盖时引物散失。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10 mM Tris pH 7.5缓冲液，室温放置几分钟，上下混匀振荡，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH 4-5），引物在这种条件下不稳定。

我们的合成报告单给出了每管引物稀释为100 μmol/L（即100 pmol/μl）浓度的加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH > 6.0）或TE缓冲液（PH 7.5-8.0）。

18. 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻融，并使用10 mM Tris pH 7.5缓冲液溶解引物。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。