篮球视频回放:蛋白纯化万金油

royluo ( 罗马情结)

本文献给YL

引子
　 2000年5月6日，我一个人在合肥三孝口书店闲诳,希望买点参考书带出国去。我注意到有一本翻译过来的书， 书名叫做《蛋白质纯化与鉴定实验指南》。这本书很奇怪，里面列出了很多具体实验的步骤和解释。我很快意识到，这本书实际上是冷泉港实验室开设的一门《蛋白质纯化与鉴定》实验课的教材。
这本书深深的吸引了我，因为里面记录的实验十分经典，涵盖了蛋白质纯化中可能用到的大部分手段，并且对实验细节有十分详尽的解释。
我对这本书爱不释手，于是就买了下来, 而且当时就动了上这门课的念头。这是一个很模糊的想法，没有想到的是，五年以后这个想法竟然实现了。
这一系列文章是我对这次上课经历的全面总结，一部分是八卦，一部分是流水账般的记叙，还有一些是从这课程学到的tricks, 最后也掺杂着自己过去做蛋白质纯化的心得。
想到哪说到哪，文字挺松散的，见笑了。
我来解释一下标题。课程结束之后，每一个学员都有一份证书，印着Per Pura Ad Astra 几个大字。这是拉丁语，直译就是“从纯化到星辰”。原始的谚语是,Per Aspera Ad Astra, 意思是through suffering to renown。所以“从纯化到星辰”实际的意思是，做好蛋白质纯化，以后就容易出人头地。呵呵。



（二）同学和老师

　冷泉港的《蛋白质纯化与鉴定》培训班历史相当悠久，从1989年开始每年都开课，到今年是第十六次。每年都是四月初开始，持续两个星期。值得一提的是，冷泉港有相当多的培训班和会议，是一个科学家交流和学习的中心。这是冷泉港享有盛名的最主要原因。
　2004年底, 我下定决心上这门课，于是递交了申请。二月份的时候的到消息，我被录取了，并且还有1000刀的tuition waiver。可我还是高兴不起来，因为还得解决1600刀(学费一共2600刀)。老板人很nice,
但是他实在没钱了，所以我只好咬咬牙自己套腰包解决了，去年的退税就这样全搭进去了,欲哭无泪啊。
　四月五号下午我赶到冷泉港，办完登记手续后被告知晚上七点全体开会，与教员和同学见面。老师一共有四个，每人负责一个模块的实验，持续三天时间, 每个老师都有一两个助手帮忙。学生则一共有16个，分成四组，轮转式的做完四个模块。我这一组其他三个人是:来自colorado Boulder 的chad,做有丝分裂的;来自Princeton的Adam,做海洋生物学的。Chad和Adam都是博士后。第三个是来自丹麦的Charlotte，是个博士生，做植物的。
现在开始八卦一下几个老师，^_^
　总负责人是来自wisconsin-madison的Richard Burgess教授, 这老头很有意思，带这个培训班已经带了十二年了，到现在还是乐此不疲。他六十年代是watson的博士后，watson似乎跟他关系很好，每年纯化课的时候，watson都会跑到培训班的实验室找Burgess聊天，同时拉他去吃饭什么的。后来的有一天，我还真的看到了watson去找他聊天。不过令人惊讶的是，watson此人相当精神，走路象年轻人。watson此人口碑很不好，很自大。连Burgess教授一次和我们吃饭的时候都承认，watson有时候口无遮拦，让他都觉得很难堪。但是Burgess又承认watson对他自己的学生很支持，很提拔，这几年又尽心尽力为冷泉港筹款，贡献巨大。
　第二位教员是来自UCLA 的Albert Courey 教授。这位教授人很nice也很幽默，四位老师中我对他印象最好。申请这个课前，我先跟他发过e-mail 询问这个课的情况，而他也鼓励我申请。这老哥研究果蝇的,但是他却负责教一组纯化转录因子的实验。我一开始不太理解，后来问他的学术经历，才明白是怎么回事。
原来这老哥博士是做生化，博后跟的是robert Tjian （钱泽南），还是做生化，研究转录因子。后来做了faculty之后，决定用果蝇做模型来研究转录因子。他那时侯不懂果蝇的遗传学，完全靠自学和到处问人。
我知道后觉得特佩服，真正的科学家不应该被自己过去所受的训练束缚死了，应该是根据研究的需要随时准备学习新东西。这老哥虽然不是最年轻的，但是却很能跟上年轻人的潮流，比如他说他有一个ipod mini,还在网上itunes商店买过歌。我还跟他就ipod聊了一阵子，因为我也有个ipod。

第三位教员是来自Texas MD anderson cancer center的sue-hwa lin教授。她是一个身材瘦小的中年妇女，台湾人，特搞笑，非常喜欢给我们讲她博士后老板的笑话。一个笑话是这样的, 有一天有一个学生向这个老兄投诉说和实验室另一人有矛盾。这个老兄想了想，然后一本正经的说，和人产生矛盾了，一般有三种选择。第一种呢，就是既然你恨他，那就杀了他好了。那个学生听了之后，差点倒了。这个老兄说看起来你丫没这胆量，那还有第二种选择，就是杀了你自己。那个学生听了几乎要吐血。这老兄一看乐了，然后说你既然没种杀人或者自杀，就剩第三种选择了, 就是ignore that guy!!!哈。还有另一个笑话，sue-hwa lin的博士后老板虽然当了老板，但是还是喜欢做实验，并且和一个博后共用一个bench。有一天那个博后指着这老兄的鼻子说，XXX呀，你把bench弄得太乱了，赶快给我清理干净了。这老兄听了之后也不怒，而是慢条斯理的辩解说，每个人都有自己喜欢的工作方式，我喜欢乱，你丫管我呢，要是不喜欢，我们可以在bench 上画条线划清界线，从此井水不犯河水。哈哈哈。这老美连三八线都出来了。第四位教授是rutgers university 的konstantin Severinov副教授，这老兄是俄罗斯人，这四位老师中 最年轻的一位。此君满头乱发，一脸大胡子，看起来很邋遢，所以一开始我对他印象不佳。后来发现此人相当nice。Konstantin特搞，有一次他做报告，他的电脑的桌面上有一堆乱七八糟的文件夹，其中有一个竟然是divorce!我告诉坐我旁边的一个老美，老美说也注意到了，认为实在是很sad，呵呵。另外，他有两个未成年的儿子，喜欢不断打他手机。结果他常常讲实验讲到一半就得停下来接电话。这个课结束之后，他还跑到冷泉港书店买了一堆虫子毛绒玩具给两个儿子做纪念品。舔犊情深，可见一斑。



（三） 不溶的sigma32

　四月六号早上，我们开始了第一模块的实验，Burgess教授负责。这老兄研究了一辈子E.Coli的RNA　polymerase。E.Coli RNA polymerase　核心酶是一个蛋白质复合体，只有合成RNA的活性，却没有识别DNA的能力。Sigma系列因子能够识别启动子, 并且与核心酶结合，从而实现转录。我们这个实验的核心主角就是其中一个因子，叫sigma32。Sigma32可以识别heat shock genes的启动子。Sigma 32 过表达在大肠杆菌里面的时候，绝大部分形成了不溶的包涵体(inclusion body),我们的任务就是要用变性剂溶解变性不溶的蛋白，然后做重折叠。
所有的buffer几乎都已经配好了，所以直接做就行了。我们先用1% Triton 来溶解细菌本身的一些蛋白，inclusion body 相当稳定，不溶于triton,所以这一步，绝大部分垃圾就被去掉了。

　下一步就是用变性剂来溶解inclusion body。用什么好呢？Burgess教授提到了sarkosyl。sarkosyl(N-十二烷基肌氨酸钠）是一种比较强的阴离子去垢剂, 0.3%的浓度就可以让包涵体溶解。sarkosyl的优点是，虽然在高浓度下有变性作用，低浓度下却对蛋白质有稳定的作用。所以用sarkosyl做重折叠之前的变性剂是再好也不过的了。
　Burgess还要我们试了经典的 Gudn HCl（盐酸胍)来变性，作为对比。inclusionbody 在这两种变性剂下很容易就溶解了。然后我们得去掉变性剂，做重折叠。怎么做呢？方法有很多种，最简单的是透析，把变性剂全部换掉。这个方法Burgess并不喜欢，因为，透析是个缓慢的过程。在透析袋里面，蛋白的浓度还是很高。折叠中间产物容易相互接触形成不溶的聚合物。另一种方法是突然稀释变性的蛋白，由于蛋白浓度相对与透析低了很多，好一点。但是问题也是类似的。Burgess提议用逐步滴加稀释的办法。就是放一大烧杯的缓冲液，里面有一个磁石可以不断混合液体，然后一滴一滴加入变性的蛋白溶液。由于烧杯里的溶液蛋白量是逐渐增加的，所以一开始蛋白折叠中间产物能够相互作用的几率大大降低了。Burgess说的还真象那么回事，可事实上，嘿嘿。我们先用试着重折叠Gudn HCl溶解的Sigma32。
一开始还好，滴到后来，溶液就变浑浊了，最后几乎成了冲淡了的牛奶那样的东东。Burgess脸色不好看，说不应该这样的。
我们一离心，沉淀出来一大堆不溶解的蛋白。剩下的上清跑了一个Poros HQ 50阴离子交换柱，拿到的蛋 白很少，回收率小于5%。失败啊。
　从这里开始，我要岔开一下，讲一些跟这个模块实验没太大关系，但是很有意思的东西。



（四）Hydrostatic pressure和跑小柱子的trick

　　 Dr. Burgess 假定我们对蛋白质纯化一无所知，所以讲得很细致。比如他特别提到了disposable column的用法。这种小柱子很简单，把beads倒进去，冲洗一下就可以用来纯化蛋白了，很方便。唯一的问题是，由于是依靠重力跑，速度有时候会十分慢。液体流经柱子速度由hydrostatic pressure (静流体压力）来决定。而hydrostatic pressure又是由实际柱高(即液体经过的长度)来决定。如果你嫌液体流得太慢（尤其是洗柱子的时候），可以在柱子下端出口连一个长的塑胶管子或者针管，这样速 度会快很多。这是很简单的小trick, 但我觉得对初做蛋白质纯化的人还是很有帮助的。
　　我知道一个例子。我原来很喜欢女生A, 有一天晚上主动等在她实验室等她做完实验，就开车送她回家。这一等不得了，从晚上七点等到了凌晨一点。这个过程中，她好像没什么事情，但是每隔20分钟，她就会去一次cold room。作完实验了之后，我好奇的问她，到底是什么试验花了这么长时间，结果她说她在用一个disposable column纯化蛋白，由于beads 稍微多了一点，速度很慢，而protocol有一步要求用数百毫升的洗液来冲洗柱子。所以她每隔二十分钟就去加洗液，所以白白花了好几个小时。我听了之后都要ft了,没想到她们实验室竟然没有人告诉她, 有简单的办法可以让柱子跑得快一点的。只要在下端出口加一个长管子，她至少可以少等两个小时。　
当然最简单的办法还不是这个，最简单的办法的是把盛有洗液的容器放高，然后利用虹吸的原理让液体 源源不断的流经柱子。同时，柱子的下端连上塑胶管，弯成一个连通器，这个连通器的高度应该略高于柱面，这样冲洗结束后，柱子就不会干。如果用这种方法，A就不用在实验室待一晚上了，因为一切都是自动完成的。
　 我现在跟A已经完全没有来往了, 但我对她映象还是十分深刻，主要就是因为她那晚跑柱子的经历。话撤远了，现在再回到蛋百质纯化课。



（五）"万金油"buffer
　 Dr. Burgess 这人特有意思，喜欢吹嘘他发现的小trick。比如，他得意说他是全美国最早用coomassie blue染蛋白胶的人。据他说，六几年的时候他看到一个澳洲的老兄的一片文章,讲述一种新奇的染料叫考马市亮蓝, 比当时流行的染料amido black灵敏十倍以上。所以他就写了一封信要了一些，结果效果奇好。我们听得都目瞪口呆。
　不过Burgess最自豪的，还是他的“万金油”buffer。他告诉我们说，他几十年了，总喜欢用这个buffer的配方，什么蛋白都喜欢这种buffer, 可以说到了包治百病的神奇地步。尽管他吹得神乎其神，配方却十分简单。这个buffer叫TGE,就是Tris, glycerol 和 EDTA。配方是这样的:

50mM Tris pH 7.9
0.5mM EDTA
50mM NaCl
5% glycerol　　

Tris EDTA NaCl 这三样都没什么，真正关键的是5%glycerol。有了这个glycerol, 很多蛋白，尤其是酶会十分稳定。这个稳定的效果是十分惊人的。Dr.Burgess就此跟我们讲了他的经历。六十年代的时候，他还是个小博士后，在watson 实验室里干，主要是纯化细菌RNApolymerase的各个亚基。那时候一个大问题是RNA polymerase纯化出来后十分不稳定, 放冰上, 过30分钟，活性还会损失一半。Burgess有一次不小心出了错误，把纯化出来的RNA polymerase和glycerol 混合了。结果意外发现，RNA polymerase 变得十分十分的稳定。

稳定到什么程度呢,就是你把这个酶加上50%glycerol，用平信从美国寄十几天到澳洲，活性还有7~80%！另外Burgess也提到，如果要保存的蛋白有二硫键，加一点DTT，防止蛋白形成非天然的二硫键, 也会对蛋白质的稳定有好处。
　为了让我们对这个 "万金油"buffer的好处有感性认识, Burgess设计了一个实验让我们做。
他之前已经准备好了在大肠杆菌中表达的GFP包涵体(inclusion body)。我们把包涵体分成两部分，一部分用guanidinium hydrochloride（盐酸胍）溶解变性，另一部分用sarkosyl (N-十二烷基肌氨酸钠）溶解变性。然后把这些溶解的GFP溶液分到一个96孔板上,每个孔10微升，然后加入２０倍的refolding buffer 来稀释，稀释了之后，变性的GFP就开始重折叠。
我们有一个hampton 卖的refolding 试剂盒，内有十几种不同配方的refolding solution。我们试了所有这些buffer 同时还试了TGE, TGE 15% glycerol, TGE 35% glycerol, TGE 45% glycerol,这四种buffer。由于GFP折叠好了才能发荧光，用一个fluorescence plater reader，我们可以实时监控折叠的效果。结果让人很吃惊，Hamton卖的这个试剂盒，虽然配方都很fancy,但是一塌糊涂，没有一种溶液能让GFP重折叠的很好。相比之下，TGE的四种溶液都很好，GFP重折叠的效率是hampton kit的几十倍。最强的是TGE 35% glycerol。
另外，不论是用Gudn HC变性还是用sarkosyl来变性，TGE glycerol 的重折叠的效果都很好。
实验结果出来后，看着我们惊讶的表情，Burgess脸上都笑开花了，呵呵。这个实验我还学到的一
个教训是,不能迷信商业化的kit, 很多kit吹得很牛，但并不一定真的好用。


（六）兴风作浪的乳糖(lactose)

　晚上每天都有人做报告，我觉得让我收获最大的是Bill Studier的报告。本来这个报告是后来才听到的， 但是由于Burgess的模块是唯一的涉及大肠杆菌钟表达蛋白的，我把这一段提前来说说。Studier这老哥是
Brookhaven National Laboratory的，一生研究T7 噬菌体，也是T7 RNA polymerase induction system(pET 系列质粒)的发明者。
T7 系统在大肠杆菌表达蛋白的应用实在太广泛了，但凡表达蛋白的兄弟姐妹们的不可能不知道这个系统。长话短说，pET系列的质粒都用T7 promoter来控制基因的表达。T7 promoter只能被T7 RNA polymerase 识别，而这个咚咚大肠杆菌是没有的。但是有一些溶原菌株,染色体里面已经整合入了由
LacUV promoter和lac operon控制的T7 RNA polymerase 基因片断。如果在细菌培养基里面加入IPTG, 来诱导T7 RNA polymerase 的表达，就可以启动目的蛋白的表达。这个系统非常强大，原因在于T7 RNA polymerase工作起来非常有效率，效率高到什么地步呢？就是表达一个蛋白，表达量可以占到大肠杆菌总蛋白量的50%! 大家可以想象，这种系统虽然很强大，但是表达量太大，对大肠杆菌有毒性，造成的结果就是大肠杆菌十分排斥表达蛋白的质粒。
这一点我深有体会。我曾经想用细菌表达一个蛋白,而且估计这个蛋白会形成包涵体。妖怪的是，用质
粒转化蛋白表达菌株BL21(DE3)怎么也不能转化，铺的板一个菌落也没有。我当时就怀疑是因为表达的
蛋白对大肠杆菌有毒性，仅仅是本底的一点表达就足以杀死细菌。我来来回回一共转化了五六次，最后 终于找到了唯一的一个菌落。虽然当时我怀疑过本底表达是罪魁祸首，但是我没有仔细想过本底是怎么 来的。
这个问题到了bill studier做报告之后，才真相大白。原来我们一般用的LB broth有三种成分，其中一种是tryptone. Tryptone是caseine的酶解产物，而casein又是milk里提取而来。由于milk 有乳糖(lactose)，tryptone里面也有乳糖的污染。Bill studier研究发现即使很微量的lactose也能有效的诱导蛋白表达。原来如此！！！
　所以要解决我原来的那个问题，用一种不含有乳糖的media做培养板就完事了。有意思的是，细菌有
一种很有意思的特点，如果培养基里有足量的glucose，细菌会优先摄取glucose,　而不能摄取lactose。
Bill studier根据这个特点研究出一种可以自动诱导的培养基。这种培养基含有成比例的glucose和lactose。细菌首先摄取glucose，不摄取lactose,当细菌长到一定密度，耗完glucose之后，就开始摄取lactose,从而开始诱导表达。所以用这种培养基养菌，很省事，接种了第二天收细菌，提蛋白就行了。
　最后Bill studier老爷子特别强调的是细菌的供氧。氧气是限制细菌生长最重要的瓶颈, 如果有足够氧气在培养基里面, 大肠杆菌的密度可以从一般的OD600 2~3 翻十倍到20~30!　要提高培养瓶的供氧，可以用baffled flask。这种flask的瓶底边缘有几处凹陷(类似于可乐塑料瓶底那样的形状)，能有效增加空气的培养基的混合。
最后，详细内容可以见下列文献:
Protein Expression and purification 41: 207-234 (2005)



（七）古怪的CDC6

　这里再给大家讲一个在大肠杆菌中表达蛋白质的例子，一个很夸张的例子，但是很有启发性。 　　Bruce Stillman 是冷泉港的现任主管，是一个绝对的牛人。不但科学做得很好，而且还很爱国。他是澳洲人，在美国待了N年，却从没有加入美国国籍，所以他只是外籍院士。我们的晚间报告有一个是他作的。他主要研究真核生物的DNA复制。这是一个到现在为止都没有完全弄明白的领域。在报告里面，他特别提到了表达纯化CDC6蛋白的经历，我觉得十分有意思。这个蛋白, 用他的话说，是"a pain in the ass"。
　CDC6是干什么的呢？这要从ORC说起。真核生物的DNA有多个复制起始位点(replication origin)，ORC(Origin Replication Complex)是一个很大的蛋白复合体，可以识别这些复制起始位点。ORC在整个细胞周期里面都是与DNA结合的。在G1期里面，CDC6这个蛋白会与ORC结合，同时让MCM(DNA解旋酶)也装载到ORC上，形成一个pre-replication protein complex。这个complex 一旦形成，DNA 复制的准备工作就完成，只等其他kinase的激活，细胞从G1进入S期，复制就开始。
　Stillman 实验室一直想表达酵母的CDC6和ORC的重组蛋白，然后做结构研究。但是到了CDC6，他们
碰到了大麻烦。首先他们尝试真核系统来表达，但是意外的是，他们发现表达出来的CDC6完全没有活性。
然后他们尝试用大肠杆菌来表达。首先发现37度诱导表达出来的蛋白不溶，重折叠也没有用。然后他们尝试在室温下诱导表达，发现蛋白虽然可溶了，但是都被降解了。然后呢，他们就想到了加一个GSTtag ,这下好了，蛋白也可溶了，也不被降解了，但是还是没有活性。他们估计是因为GST可以形成dimer，干扰CDC6的正常功能。所以呢，他们重新做了一个construct,在GST和CDC6序列中间加了一个蛋白酶切割位点。正当他们满心欢喜的以为问题解决了的时候，意外又出现了。有GST的CDC6是可溶的，可是一旦把GST切掉了，CDC就沉淀出来了....#%#^