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第三节 工业微生物菌种的选育

　　用发酵法生产产品，首先要有 的菌种。因此必须进行菌种选育工作。菌种选育工作大幅度提高了微生物发酵的产量，促进了微生物发酵工业的迅速发展。通过菌种选育，抗生素、氨基酸、维生素、药用酶等产物的发酵产量提高了几十倍、几百倍、甚至几千倍。菌种选育在提高产品质量、增加品种、改善工艺条件和生产菌的遗传学研究等方面也发挥重大作用。菌种选育的目的是改良菌种的特性，使其符合工业生产的要求。
　　菌种选育包括经验育种和定向育种，其中经验育种又分自然选育和诱变育种。在生产过程中，不经过人工诱变处理，根据菌种的自发突变（亦称自然突变）而进行菌种筛选的过程，叫做自然选育。由于野生菌株生产能力低，往往不能满足工业上的需要。因为在正常生理条件下，微生物依靠其代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖。但是，发酵工业生产，需要培养微生物使之积累大量的代谢产物。为此，采用种种措施来打破菌的正常代谢，对代谢流进行调节控制，从而大量积累我们所需要的代谢产物。例如青霉素的原始生产菌种产生黄色色素，使成品带黄色，经过菌种选育，生产菌不再分泌黄色色素；土霉素产生菌在培养过程中产生大量泡沫，经诱变处理后改变了遗传特性，发酵泡沫减少，可节省大量消泡剂并增加培养液的装量；红霉素等品种发酵遇有噬菌体侵袭时，发酵产量大幅度下降，甚至被迫停产，菌种经诱变处理获得抗噬菌体的特性，就可保证发酵生产的正常进行。

　　自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。
⒈ 从自然界分离获得菌株
　　从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。
　　⑴ 采样　采样地点的确定要根据筛选的目的、微生物的分布概况及菌种的主要特征与外界环境关系等，进行综合、具体地分析来决定。如果预先不了解某种生产菌的具体来源，一般可从土壤中分离。采样的方法多是在选好地点后，用小铲去除表土，取离地面5～15 cm处的土壤几十克，盛入预先消毒好的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，记录采样时间、地点、环境情况等，以备考查。一般土壤中芽孢杆菌、放线菌和霉菌的孢子忍耐不良环境的能力较强，不太容易死亡。但是，由于采样后的环境条件与天然条件有着不同程度的差异，一般应尽快分离。对于酵母类或霉菌类微生物，由于它们对碳水化合物的需要量比较多，一般又喜欢偏酸性环境，所以酵母类、霉菌类在植物花朵、瓜果种子及腐殖质含量高的土壤等上面比较多。
　　⑵ 增殖培养　收集到的样品，如含目标菌株较多，可直接进行分离。如果样品含目标菌种很少，就要设法增加该菌的数量，进行增殖(富集)培养。所谓增殖培养就是给混合菌群提供一些有利于所需菌株生长或不利于其它菌型生长的条件，以促使目标菌株大量繁殖，从而有利于分离它们。例如筛选纤维素酶产生菌时，以纤维素作为唯一碳源进行增殖培养，使得不能分解纤维素的菌不能生长；筛选脂肪酶产生菌时，以植物油作为唯一碳源进行增殖培养，能更快更准确地将脂肪酶产生菌分离出来。除碳源外，微生物对氮源、维生素及金属离子的要求也是不同的，适当地控制这些营养条件对提高分离效果是有好处的。另外，控制增殖培养基的pH值，有利于排除不需要的、对酸碱敏感的微生物；添加一些专一性的抑制剂，可提高分离效率，例如在分离放线菌时，可先在土壤样品悬液中加10％的酚液数滴，以抑制霉菌和细菌的生长；适当控制增殖培养的温度，也是提高分离效率的一条好途径。
　　⑶ 纯种分离　通过增殖培养还不能得到微生物的纯种，因为生产菌在自然条件下通常是与各种菌混杂在一起的，所以有必要进行分离纯化，才能获得纯种。纯种分离方法常选用单菌落分离法。把菌种制备成单孢子或单细胞悬浮液，经过适当的稀释后，在琼脂平板上进行划线分离。划线法是将含菌样品在固体培养基表面作有规则的划线(有扇形划线法、方格划线法及平行划线法等)，菌样经过多次从点到线的稀释，最后经培养得到单菌落。也可以采用稀释法，该法是通过不断地稀释，使被分离的样品分散到最低限度，然后吸取一定量注入平板，使每一微生物都远离其他微生物而单独生长成为菌落，从而得到纯种。划线法简单且较快，稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的概率大，特别适宜于分离具有蔓延性的微生物。采用单菌落分离法有时会夹杂一些由两个或多个孢子所生长的菌落，另外不同孢子的芽管间发生吻合，也可形成异核菌落。要克服这些缺点，就要特别重视单孢子悬浮液的制备方法。为使单孢子悬浮液有良好的分散度，力求去除菌丝断片或粘接在一起的成串的孢子，可采用如下方法制备单孢子悬浮液：① 对于细菌，因其在固体斜面培养基上常粘在一起，故要求转种到新鲜肉汤液体中进行培养，以取得分散且生长活跃的菌体；② 对放线菌和霉菌的孢子，采用玻璃珠或石英砂振荡打散孢子后，用滤纸或棉花过滤；对某些黏性大的孢子，常加入0.05％的分散剂(如吐温80，Tween 80)以获得分散的单个孢子。
为了提高筛选工作效率，在纯种分离时，培养条件对筛选结果影响也很大，可通过控制营养成分、调节培养基pH值、添加抑制剂、改变培养温度和通气条件及热处理等来提高筛选效率。平板分离后挑选单个菌落进行生产能力测定，从中选出优良的菌株。
　　⑷ 生产性能的测定　由于纯种分离后，得到的菌株数量非常大，如果对每一菌株都作全面或精确的性能测定，工作量十分巨大，而且是不必要的。一般采用两步法，即初筛和复筛，经过多次重复筛选，直到获得1～3株较好的菌株，供发酵条件的摸索和生产试验，进而作为育种的出发菌株。这种直接从自然界分离得到的菌株称为野生型菌株，以区别于用人工育种方法得到的变异菌株（亦称突变株）。
⒉ 从自发突变体中获得菌株
　　一般微生物可遗传的特性发生变化称为变异，又称突变，是微生物产生变种的根源，同时也是育种的基础。自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。目前，发酵工业中使用的生产菌种，几乎都是经过人工诱变处理后获得的突变株。这些突变株是以大量生成某种代谢产物(发酵产物)为目的筛选出来的，因而它们属于代谢调节失控的菌株。微生物的代谢调节系统趋向于最有效地利用环境中的营养物质，优先进行生长和繁殖，而生产菌种常常是打破了原有的代谢调节系统的突变株，因此常常表现出生活力比野生菌株弱的特点。此外，生产菌种是经人工诱变处理而筛选获得的突变株，遗传特性往往不够稳定，容易继续发生变异，使得生产菌株呈现出自然变异的特性，如果不及时进行自然选育，通常会导致菌种性能变化，使发酵产量降低，但也有变异使菌种获得优良性能的情况。
　　自发突变的频率较低，因此自然选育筛选出来的菌种，不能满足育种工作的需要，不完全符合工业生产的要求，如产量低、副产物多、生长周期长等。因而不能仅停留在“选”种上，还要进行“育”种。如通过诱变剂处理菌株，就可以大大提高菌种的突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有优良特性的变异菌株，这种方法就称为诱变育种。

　　诱变育种和其他方法相比较，人工诱变能提高突变频率和扩大变异谱，具有速度快、方法简便等优点，是当前菌种选育的一种主要方法，在生产中使用得十分普遍。但是诱发突变随机性大，因此诱发突变必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。如果筛选方法得当，也有可能定向地获得好的变异株。
　　诱变育种的主要环节是：① 以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液(细胞或孢子)，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA碱基变异频率大幅度提高；② 用合适的方法淘汰负变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。诱变育种的程序如图4-1所示。

图4-1　诱变育种的程序
　　⒈ 出发菌株的选择
　　工业上用来进行诱变处理的菌株，称为出发菌株(parent strain)。在许多情况下，微生物的遗传物质具有抗诱变性，这类遗传性质稳定的菌株用来生产是有益的，但作为诱变育种材料是不适宜的。出发菌株通常有三种：① 从自然界分离得到的野生型菌株；② 通过生产选育，即由自发突变经筛选得到的高产菌株；③ 已经诱变过的菌株，这类菌株作为出发菌株较为复杂。一般认为诱变获得高产菌株，再诱变易产生负突变，再度提高产量比较困难。采用连续诱变的方法，在每次诱变之后选出3～5株较好的菌株继续诱变，如果遇到高产菌株再诱变进一步提高产量效果不佳时，可以先行杂交，再作为诱变的出发菌株，这样有可能收到比较好的效果。
　　⒉ 菌悬液的制备
　　采用生理状态一致(用选择法或诱导法使微生物同步生长)的单细胞或孢子进行诱变处理，这样不但能均匀地接触诱变剂，还可减少分离现象的发生。处理前细胞尽可能达到同步生长状态，细胞悬液经玻璃珠振荡打散，并用脱脂棉或滤纸过滤，以达到单细胞状态。
一般处理细菌的营养细胞，采用生长旺盛的对数期，其变异率较高且重现性好。霉菌的菌株一般是多核的，因此对霉菌都用孢子悬浮液进行诱变，对放线菌一般也如此。但孢子生理活性处于休眠状态，诱变时不及营养细胞好，因此最好采用刚刚成熟时的孢子，其变异率高。或在处理前将孢子培养数小时，使其脱离静止状态，则诱变率也会增加。
　　一般处理真菌的孢子或酵母时，其菌悬液的浓度大约为106个／mL，细菌和放线菌的孢子的浓度大约为108个／mL。
　　⒊ 前培养
　　诱变处理前，将细胞在添加嘌呤、嘧啶等碱基或酵母膏的培养基中培养20～60 min，再进行诱变处理，则变异率可大幅度提高。
　　⒋ 诱变
　　能诱发基因突变并使突变率提高到超过自然突变水平的物理化学因子都称为诱变剂。可分为物理诱变剂和化学诱变剂两大类。
　　⒌ 变异菌株的分离和筛选
　　通过诱变处理，在微生物群体中出现各种突变型的个体，但其中多数是负突变体。为在短时间内获得好的效果，应采用效率较高的筛选方案或筛选方法。实际工作中，一般分初筛和复筛两阶段进行，前者以量为主，后者以质为主。

　　诱变育种一般采用物理、化学诱变因素使微生物DNA的碱基排列发生变化，以使排列错误DNA模板形成异常的遗传信息，造成某些蛋白结构变异，而使细胞功能发生改变。诱变育种不仅可以提高菌株的生产能力，而且还可以改进产品的质量，扩大品种，简化工艺。在科学实验和生产上都得到了广泛应用。目前应用于工业化的生产菌几乎毫无例外地都是经过诱变的改良菌种。
　　按照生产的要求，根据生物的遗传和变异的理论，用人工的方法造成菌种变异，再经过筛选，而达到菌种选育的目的。即就是通过诱变改善菌种的特性，获得优良菌株。
诱变育种方案包括突变的诱发、突变株的筛选和突变高产基因的表现。这些环节是相互联系，缺一不可的。在诱变育种的早期阶段，工作一般是顺利的，高产突变株不断涌现。但经过长期诱变得到的高产突变株，再进一步提高时，进展逐渐变慢，困难也越来越多。因此，应在早期周密地设计一个选育工作方案。
　　诱发突变有可能出现多种多样变异性突变株。除了高产性状外，还要考虑其他有利性状。例如，生长速度快、产孢子多；消除某些色素或无益组分；能有效利用廉价发酵原材料；改善发酵工艺中某些缺陷(如泡沫过多、对温度波动敏感、菌丝量太多、自溶早、过滤困难等)。但是所定的筛选目标不可太多，要充分估计人力、物力和测试能力等，要考虑实现这些目标的可能性。要选出一个达到一定产量的高产菌株，往往要筛选数千个左右的突变株，经历多次诱变和筛选，才能达到目的。
　　㈠ 突变的诱发
　　诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。例如紫外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体就是一种前突变。前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变，也可以经过修复重新回到原有的结构，即不发生突变。许多环境因素可以影响突变的诱发过程，从而影响突变率。以下将讨论从诱变剂进入细胞到突变型出现的整个过程以及影响这一过程的一些因素。
　　⒈ 诱变剂接触DNA分子
　　诱变剂要进入细胞才能诱发突变，因此细胞对诱变剂的透性将影响诱变结果。诱变剂在接触DNA之前要经过细胞质，细胞质的某些组分和某些酶可和诱变剂相互作用而影响诱变效果。
　　突变的诱发还和基因所处的状态有关，而基因的状态又和培养条件有关。在培养基中加入诱导剂使基因处于转录状态，可能有利于诱变剂的作用。据认为在转录时，DNA双链解开更有利于诱变作用。
　　⒉ DNA损伤的修复
　　DNA损伤的修复和基因突变有着密切的关系。已发现微生物有五种修复DNA损伤方式，它们是：光复活作用、切补修复、重组修复、SOS修复系统、DNA多聚酶的校正作用。

图4-2　三种DNA修复作用
　　⑴ 光复活作用　人们发现某些经紫外线照射过的放线菌孢子，如果在可见光下培养时，存活数明显大于在黑暗中培养的同一样品。经研究证明这是有一种为可见光所激活的酶在起作用。这种酶能和经紫外线照射过的DNA在黑暗中结合，形成的复合物置于可见光下，酶和DNA解离，解离下来的DNA分子中不再存在原来的胸腺嘧啶二聚体。见图4-2(a)。
　　⑵ 切补修复　切补修复是在四种酶的协同作用下进行DNA损伤修复，这四种酶都不需要可见光的激活。首先在胸腺嘧啶二聚体5’端，在核酸内切酶的作用下造成单链断裂；其次在核酸外切酶的作用下切除胸腺嘧啶二聚体；然后在DNA多聚酶Ⅰ、Ⅲ的作用下进行修补合成；最后在DNA连接酶的作用下形成一个完整的双链结构。见图4-2 (b)。
　　⑶ 重组修复　重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行，所以又称为复制后修复。重组修复是在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下进行修复作用。以带有二聚体的单链为模板合成互补单链，可是在每一个二聚体附近留下一个空隙。一般认为通过染色体交换，空隙部位就不再面对着二聚体，而是面对着正常的单链，在这种情况下，DNA多聚酶和连接酶就能把空隙部位修复好。见图4-2 (c)。
　　⑷ SOS修复系统　这是一种能够造成误差修复的“呼救信号”修复系统。当DNA受到诱变剂损伤而阻断DNA复制过程时，DNA损伤相当于一个呼救信号，促使细胞中的有关酶系解除阻遏，而进行DNA的修复。在修复过程中，DNA多聚酶在无模板的情况下进行DNA的修复合成，并将合成的DNA片段插入受损DNA的空隙处。SOS修复系统的修复作用容易导致基因突变，大多数经诱变所获得的突变来源于此修复系统的作用。
　　⑸ DNA多聚酶的校正作用　除了上述种种修复作用以外，细胞还具有对复制过程中出现差错加以校正的功能。大肠杆菌中DNA的复制依赖于三种DNA多聚酶(多聚酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)的作用，这三种酶除了对于多核苷酸的多聚作用以外，还具有3’到5’核酸外切酶的作用。一般认为依靠DNA多聚酶的这一作用，能在复制过程中随时切除不正常的核苷酸。如果DNA多聚酶发生突变而使其核酸外切酶活性减弱，那么，它切除不正常核苷酸的能力减弱，菌体的突变率相应地提高，成为增变突变型。DNA多聚酶为DNA修复作用所必需，所以增变突变型对于诱变剂的作用格外敏感。
　　⒊ 从前突变到突变
　　前突变形成后，细胞中几种修复系统就会对它施加作用。从对突变诱发的影响看，修复系统可以分为校正差错和引起差错这两类。一般认为光复活作用、切补修复和DNA多聚酶校正作用这三种修复作用具有校正差错的性质而不利于突变的诱发，而重组修复和SOS修复系统这两种修复作用具有引起差错的性质而有利于突变的发生。
　　可以认为，一切影响这些修复系统中的酶活性的因素都能影响由前突变到突变这一过程。例如，咖啡碱能抑制切补修复系统，因而增强诱变作用；氯霉素能抑制细菌的蛋白质合成，从而抑制了依赖于蛋白质合成的SOS修复系统和重组修复，降低诱变率。相反地，一切有利于蛋白质合成的因素都有利于提高突变率。
　　与突变有关的一些酶的激活剂或抑制剂也会影响突变率。Ba2+对DNA多聚酶的3’核酸外切酶活性有抑制作用，从而可提高突变率。
　　从上述可以看出，诱变前后的处理可影响诱变的效果。其原因主要有两方面：一是通过影响与DNA修复作用有关的酶活性而影响诱变的效果；二是通过使诱变的目的基因处于活化状态(复制或转录状态)，使之更容易被诱变剂所作用，从而影响目的基因的突变率。
　　⒋ 从突变到突变表型
　　突变基因的出现并不等于突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型迟延。表型迟延有两种原因：分离性迟延和生理性迟延。
　　⑴ 分离性迟延　分离性迟延实际上是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态(野生型的基因和突变型的基因并存于同一细胞中)，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态(一细胞中只有突变型基因，没有野生型基因)时，其性状才得以表达。
　　大肠杆菌在对数生长期含有2～4个核质体，当其中一个核发生突变时，这个细胞变成异核体。如果突变表型表现为某个基因所控制的产物的丧失，那么这一突变在异核体内就是隐性的。因为其他的核继续生产该基因控制的产物。需要经历1～2个世代，通过细胞分裂而出现同一细胞的所有核中都带有这一突变基因时，突变表型才出现。
　　⑵ 生理性迟延　突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。而这些原有基因产物的浓度降低到能改变表型的临界水平以前，细胞已经分裂多次，经过了好几个世代。例如某个产酶基因发生了突变，可是细胞中原有的酶仍在起作用，细胞所表现的仍是野生型表型。只有通过细胞分裂，原有的酶已经足够稀释或失去活性时，才出现突变型的表型。生理性迟延最明显的例子是噬菌体抗性突变的表达。用诱变剂处理噬菌体敏感菌，将存活菌体立即分离在含噬菌体的培养基上，其抗性菌株不立即出现。而将存活菌先在不含噬菌体的培养基中繁殖几代后，再分离后接到含有噬菌体的培养基中，则可得到大量抗性菌。有些诱发突变要经历十几个世代才能表达。敏感菌对某一些噬菌体敏感是因为其细胞表面具有该噬菌体的受体，抗性菌因不产生该受体而对噬菌体具有抗性。但是基因发生了抗性突变而细胞表面具有受体的细胞仍会受到噬菌体的感染，抗性突变的表型必须等到经过多次细胞分离，细胞表面不再存在有受体时才能表现出来。
　　㈡ 诱变剂的种类及选择
　　⒈ 诱变剂
　　物理诱变剂主要为各种射线，如紫外线、X射线、α射线、β射线、γ射线和超声波等，其中以紫外线应用最广，紫外光谱作用光谱正好与细胞内的核酸的吸收光谱相一致，因此在紫外光的作用下能使DNA链断裂、DNA分子内和分子间发生交联形成嘧啶二聚体，从而导致菌体的遗传性状发生改变。
　　化学诱变剂的种类较多，常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍、亚硝酸、氮芥等。它们作用于微生物细胞后，能够特异地与某些基团起作用，即引起物质的原发损伤和细胞代谢方式的改变，失去亲株原有的特性，并建立起新的表型。所谓“表型”是指某一生物个体能够观察到的特殊性状。所谓“基因型（遗传型）”是指某一生物个体所含有的全部遗传因子（即基因组）所携带的遗传信息。
　　诱变剂亚硝基胍和甲基磺酸乙酯虽然诱变效果好，但由于多数引起碱基对转换，得到的变异株回变率高。电离辐射、紫外线和吖啶类等诱变剂，能引起缺失、阅读密码组移动等巨大损伤，则不易产生回复突变。诱变处理剂量的选择是一个比较复杂的问题，一般正突变较多出现在偏低剂量中，而负突变则较多地出现于偏高剂量中。对于经过多次诱变而提高了产量的菌株，在较高剂量负突变率更高。因此，目前处理量已从以前采用的死亡率90％～99％减低为死亡率70％～80％。各种化学诱变剂常用的剂量和处理时间如表4-1。
表4-1　各种化学诱变剂常用的剂量、处理时间

　　诱变剂的选择主要是根据已经成功的经验，诱变作用不但决定于诱变剂，还与菌种的种类和出发菌株的遗传背景有关。一般对遗传上不稳定的菌株，可采用温和的诱变剂，或采用已见效果的诱变剂；对于遗传上较稳定的菌株则采用强烈的、不常用的、诱变谱广的诱变剂。要重视出发菌株的诱变系谱，不应常采用同一种诱变剂反复处理，以防止诱变效应饱和；但也不要频频变换诱变剂，以避免造成菌种的遗传背景复杂，不利于高产菌株的稳定。
　　选择诱变剂时，还应该考虑诱变剂本身的特点。例如紫外线主要作用于DNA分子的嘧啶碱基，而亚硝酸则主要作用于DNA分子的嘌呤碱基。紫外线和亚硝酸复合使用，突变谱宽，诱变效果好。
　　⒉ 影响诱变效果的因素
　　除了出发菌株的遗传特性和诱变剂会影响诱变效果之外，菌种的生理状态、被处理菌株的预培养和后培养条件以及诱变处理时的外界条件等都会影响诱变效果。
菌种的生理状态与诱变效果有密切关系，例如有的碱基类似物、亚硝基胍(NTG)等只对分裂中的DNA有效，对静止的或休眠的孢子或细胞无效；而另外一些诱变剂，如紫外线、亚硝酸、烷化剂、电离辐射等能直接与DNA起反应，因此对静止的细胞也有诱变效应，但是对分裂中的细胞更有效。因此，放线菌、真菌的孢子诱变前经培养稍加萌发可以提高诱变率。
诱变处理前后的培养条件对诱变效果有明显的影响。可在培养基中添加某些物质(如核酸碱基、咖啡因、氨基酸、氯化锂、重金属离子等等)来影响细胞对DNA损伤的修复作用，使之出现更多的差错，而达到提高诱变率的目的。例如菌种在紫外线处理前，在富有核酸碱基的培养基中培养，能增加其对紫外线的敏感性。相反，如果菌种在进行紫外线处理以前，培养于含有氯霉素(或缺乏色氨酸)的培养基中，则会降低突变率。紫外线诱变处理后，将孢子液分离于富有氨基酸的培养基中，则有利于菌种发生突变。
　　诱变率还受到其他外界条件，例如温度、氧气、pH值、可见光等的影响。
　　㈢ 出发菌株的选择
　　突变的诱发受到菌种的遗传特性、诱变剂、菌种的生理状态以及诱变处理时环境条件的影响。出发菌株的选择是诱变育种工作成败的关键。出发菌株的性能，如菌种的系谱、菌种的形态、生理、传代、保存等特性，对诱变效果影响很大。挑选出发菌株应考虑如下几点。
　　① 选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体（表型相同，基因型不同）的影响。从宏观上讲，就是要选择发酵产量稳定、波动范围小的菌株为出发菌株。如果出发菌株遗传性不纯，可以用自然分离或用缓和的诱变剂进行处理，取得纯种作为出发菌株。这样虽然要花一些时间，但效果更好。
　　② 选择出发菌株，不仅是选产量高的，还应该考虑其他因素。如产孢子早而多，色素多或少，生长速度快等有利于合成发酵产物的性状。特别重要的是选择的出发菌株应当具有我们所需要的代谢特性。例如，适合补料工艺的高产菌株是从糖、氮代谢速度较快的出发菌株得来的。用生活力旺盛而发酵产量又不很低的形态回复突变株作为出发菌株，常可收到好的效果。
　　③ 选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，不但可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。生产中经过长期选育的菌株，有时会对诱变剂不敏感。在此情况下，应设法改变菌株的遗传型，以提高菌株对诱变剂的敏感性。杂交、诱发抗性突变和采用大剂量的诱变剂处理均能改变菌株的遗传性而提高菌株对诱变剂的敏感性。
　　㈣ 筛选的方法
　　⒈ 制定筛选方案

图4-3　诱变筛选的典型流程
　　方案设计的中心内容是确定诱变筛选流程，流程示意如图4-3。整个流程可按诱变和筛选两部分说明如下。
　　由出发菌种开始，制出新鲜孢子悬浮液(或细菌悬浮液)作诱变处理，然后以一定稀释度涂布平皿，至平皿上长出单菌落为止的各步骤为诱变过程。出发菌种的斜面非常重要。其培养工艺最好是经过试验已知的最佳培养基和培养条件。要选取对诱变剂最敏感的斜面种龄，要求孢子数适中而新鲜。在平皿内倾入10 mL左右的培养基，凝固后，加入一定量经诱变处理的孢子液，用涂布器涂匀后进行单菌落分离培养。
　　筛选过程主要包括传种斜面、菌株保藏和筛选高产菌株这三项工作。长出单菌落后，随机挑选单菌落进行生产能力测定。每一被挑选的单菌落传种斜面后，再由斜面接入模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其生产能力。挑选生长良好的正常形态的菌落传种斜面，还可适当挑选少数形态或色素有变异的菌落。经诱变处理，形态严重变异的往往为低产菌株。经筛选挑出比对照生产能力高10％以上的菌株，要制成砂土管或冷冻管留种保藏。这一步非常重要，可保证高产菌株不会得而复失。诱变处理前后孢子要计数，以控制处理液的孢子数和统计诱变致死率，常用于处理的孢子液浓度为105～l08个／mL。孢子计数采用血球计数法在显微镜下直接计数。致死率是通过处理前后孢子液活菌计数来测定。
　　⒉ 营养缺陷型的筛选方法
　　营养缺陷型（auxotroph）是指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。原养型（prototroph）一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型（wild type）相同，如能在基本培养基（MM）上生长，但基因型不一定相同。
　　营养缺陷型的筛选，一般是经诱变后，再经中间培养、淘汰野生型、检出营养缺陷型、确定生长谱等步骤。中间培养的目的是减少以后筛选中再产生分离子，其培养基是完全培养基（CM）或补充培养基（SM），并且培养过夜。淘汰野生型菌株的方法有：抗生素法、菌丝过滤法、差别杀菌法和饥饿法等。其目的在于浓缩缺陷型菌株。当诱变后的缺陷型数量较大时，也可省去中间培养和淘汰野生型等过程。营养缺陷菌株的检出方法有：逐个测定法、夹层平板法、限量营养法和影印接种法等。经过检出确定为营养缺陷型菌株之后，尚需进一步确定它的缺陷型是氨基酸、维生素，还是嘌呤、嘧啶缺陷型。
　　经过平皿初筛，确定营养缺陷或其他标记的变异性状后，即可进行发酵试验，检查其生产性状，经过生产性状比较，再平行试验比较，并结合生产的其他因素考虑，可确定用于生产或进一步改良诱变的菌株，进行保藏或扩大试验，直至用于生产等。
　　⒊ 突变株的筛选
　　诱变处理后的孢子传种斜面后，进行生产能力测试筛选。为了获得优良菌株，初筛菌株的量要大，发酵和测试的条件都可粗放一些。例如可以采用琼脂块筛选法进行初筛，也可以采用一个菌株进一个摇瓶的方法进行初筛。随着以后一次一次的复筛，对发酵和测试条件的要求应逐步提高，复筛一般每个菌株进3～5个摇瓶，如果生产能力继续保持优异，再重复几次复筛。初筛和复筛均需有亲株作对照以比较生产能力是否优良。复筛后，对于有发展前途的优良菌株，可考察其稳定性、菌种特性和最适培养条件等。真正的高产菌株，往往需要经过产量提高的逐步累积过程，才能变得越来越明显。所以有必要多挑选一些出发菌株进行多步育种，以确保挑选出高产菌株。
　　根据形态变异淘汰低产菌株。突变一旦发生，突变细胞能够把突变的性状遗传给子代。如果诱变处理确实有效的话，在一定的培养基上，很容易发现一些菌落的性状或色泽等和亲代菌株不同，这可作为诱变效果的定性指标。某些菌落形态与生产性能有直接的相关性，可采取在平皿直接筛选。如在灰黄霉素生产菌的选育中，菌落暗红色变深者，产量就提高。但就目前的研究，多数变异其菌落外观形态与生理的相应关系尚未完全清楚。
　　根据平皿直接反应挑取高产菌株。所谓平皿直接反应是指每个菌落产生的代谢产物与培养基内的指示物作用后的变色圈或透明圈等。因其可表示菌株的生产活力高低，所以可以作为初筛的标志，常用的有纸片培养显色法、透明圈法、琼脂片法、深度梯度法。菌体细胞经诱变剂处理后，要从大量的变异菌株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来，这需要有明确的筛选目标和筛选方法，需要进行认真细致的筛选工作。育种工作中常采用随机筛选和理性化筛选这两种筛选方法。
　　⑴ 随机筛选　随机筛选即菌种经诱变处理后，进行平板分离，随机挑选单菌落，从中筛选高产菌株。为了提高筛选效率，可采用下列方法增大筛选量。
　　① 摇瓶筛选法。这是生产上一直使用的传统方法。即将挑出的单菌落传种斜面后，再由斜面接入模拟发酵工艺的摇瓶中培养，然后测定其发酵生产能力。选育高产菌株的目的是要在生产发酵罐中推广应用，因此，摇瓶的培养条件要尽可能和发酵生产的培养条件相近。但是，实际上摇瓶培养条件很难和发酵罐培养条件相同。摇瓶筛选的优点是培养条件与生产培养条件相接近。但工作量大、时间长、操作复杂。
　　② 琼脂块筛选法。这是一种简便、迅速的初筛方法。将单菌落连同其生长培养基(琼脂块)用打孔器取出，培养一段时间后，置于鉴定平板以测定其发酵产量。琼脂块筛选法的优点是操作简便、速度快。但是，固体培养条件和液体培养条件之间是有差异的，利用此法所取得的初筛结果必须经摇瓶复筛加以验证。
　　③ 筛选自动化和筛选工具微型化。近年来，在研究筛选自动化方面有很大进展，筛选实验实现了自动化和半自动化，省去了繁琐的劳动，大大提高了筛选效率。筛选工具的微型化也是很有意义的，例如将一些小瓶子取代现有的发酵摇瓶，在固定框架中振荡培养，可使操作简便，又可加大筛选量。
　　⑵ 理性化筛选　传统的菌种选育是采用随机筛选的方法。由于正变异株出现的几率小，产量提高的范围往往在生物学波动的范围内，因而选出一株高产菌株需要耗费大量的人力、物力。而且，随着发酵产量不断提高，用随机筛选方法获得高产菌株的几率越来越小。近年来，随着遗传学、生物化学知识的积累，人们对于代谢途径、代谢调控机制了解得更多，因而筛选方法逐渐从随机筛选转向理性化筛选。理性化筛选是指运用遗传学、生物化学的原理，根据产物已知的或可能的生物合成途径、代谢调控机制和产物分子结构来进行设计和采用一些筛选方法，以打破微生物原有的代谢调控机制，获得能大量形成产物的高产突变株。微生物的代谢产物不同，其筛选方法也有所不同。
　　① 初级代谢产物高产菌株的筛选。根据代谢调控的机理，氨基酸、核苷酸、维生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普遍存在着反馈阻遏或反馈抑制，这对于生产菌本身是有意义的，因为可以避免合成过多的代谢物而造成能量的浪费。
表4-2　反馈阻遏与反馈抑制的比较

　　酶活性的抑制包括竞争性抑制和反馈抑制。反馈抑制是指反应途径中某些中间产物或末端产物对该途径中前面反应的影响。凡使反应加速的称为正反馈，凡使反应减速的称为负反馈。酶活性的调节机制可用Monod提出的变构酶学说予以说明。
末端产物的反馈抑制普遍存在于合成途径。有两种似上的末端产物的分支代谢途径的反馈抑制，作用机制较复杂，其调节方式见图4-4。

图4-4　反馈抑制模式图
　　(a) 协同反馈抑制　此种抑制作用的特点是分支途径的几种末端产物同时过量时才抑制共同途径中的第一个酶活性。如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)合成天冬氨酸族氨基酸时，天冬氨酸激酶受到赖氨酸和苏氨酸的协同反馈抑制。
　　(b) 累积反馈抑制　此种抑制作用的特点是每一种末端产物按一定百分率单独抑制共同途径中第一个酶活性。各种产物间既无协同效应，又无拮抗作用。它们抑制的酶，有的是同功酶(能催化同一种生化反应，但酶分子结构有所不同的一组酶)，有的是多功能酶(指结构上仅为一种多肽，但却具有两种或两种以上催化活力的酶蛋白)。如谷氨酰胺合成酶受到八种末端产物的累积反馈抑制。
　　(c) 增效反馈抑制　其特点是代谢途径中任何一种末端产物过量时，仅部分抑制共同反应途径中的第一个酶活性，但是两个末端产物同时过量时，其抑制作用可超过各产物存在的抑制能力的总和。此种调节方式发现在6-氨基嘌呤核苷酸和6-酮基嘌呤核苷酸生物合成途径。两类核苷酸各自都能部分地抑制磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶的活性。而6-氨基和6-酮基嘌呤核苷酸混合物(GMP+AMP或AMP+IMP)对该酶有强烈地抑制作用。
　　(d) 顺序反馈抑制　每个分支末端产物抑制分支后的第一个酶，产生部分抑制作用。如枯草杆菌合成芳香族氨基酸时的反馈抑制作用。
但是，在工业生产中，需要生产菌产生大量的氨基酸、核苷酸、维生素等产物。因此，需要打破微生物原有的反馈调节系统。育种工作要达到此目的，可从以下两个方面着手。
　　Ⅰ 降低终产物浓度
　　(a) 筛选终产物营养缺陷型　如图4-5所示。在图4-5中，假设所需要的发酵产物是C，而该生物合成途径的终产物是E，则可筛选E的营养缺陷型；如果营养缺陷型是由C→D的代谢被阻断，则可解除终产物E对发酵产物C合成的反馈阻遏或反馈抑制，而积累大量的发酵产物C。

图4-5　在简单的代谢途径中积累中间产物

图4-6　赖氨酸的大量生成
　　实例见图4-6。在谷氨酸棒杆菌的原始菌株中，赖氨酸和苏氨酸协同反馈抑制天冬氨酸激酶，获得了一个缺少高丝氨酸脱氢酶的突变株。它的生长需要苏氨酸和蛋氨酸。如果苏氨酸以限制生长的浓度加入时，协同反馈抑制被打破而大量产生赖氨酸，谷氨酸棒杆菌的双氢吡啶二羧酸合成酶对赖氨酸的反馈抑制不敏感。
　　总之，筛选终产物营养缺陷型适合于下面三种情况：发酵产物为某一直线合成途径的中间产物如图4-5所示；发酵产物为某一分枝合成途径的中间产物；发酵产物为某一分枝合成途径的一个终产物时，可筛选该分枝合成途径的另一终产物的营养缺陷型，如图4-6所示。
　　(b) 筛选细胞膜透性改变的突变株　使之大量分泌排出终产物，以降低细胞内终产物浓度，从而避免终产物反馈调节。例如，用谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型(biotin deficiency)进行谷氨酸发酵，生物素是合成脂肪酸所必需的，而脂肪酸又是组成细胞膜类脂的必要成分。该缺陷型在生物素处于限量的情况下，不利于脂肪酸的合成，因而使细胞膜的渗透性发生变化，有利于将谷氨酸透过细胞膜分泌至胞外的发酵液中。如果使用油酸缺陷型菌株或者甘油缺陷型菌株，即使在生物素过量的条件下，也可使谷氨酸在胞外大量积累。
　　Ⅱ 筛选抗反馈突变菌株
　　(a) 筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株　分离抗反馈突变株的最常用的方法是用与代谢产物结构类似的化合物(结构类似物)处理微生物细胞群体，杀死或抑制绝大多数细胞，选出能大量产生该代谢物的抗反馈突变株。结构类似物一方面具有和代谢物相似的结构，因而具有和代谢物相似的反馈调节作用，阻碍该代谢物的生成；另一方面它不同于代谢物，不具有正常的生理功能，对细胞的正常代谢有阻碍作用，会抑制菌的生长或导致菌的死亡。例如，一种氨基酸终产物，在正常的情况下，参与蛋白质合成，过量时可抑制或阻遏它自身的合成酶类。如果这种氨基酸的结构类似物也显示这种抑制或阻遏，但却不能用于蛋白质的合成，那么当用这种结构类似物处理菌株时，大多数细胞将由于缺少该种氨基酸而不能生长或者死亡，而那些对该结构类似物不敏感的突变株，仍然能够合成该种氨基酸而继续生长。某些菌株所以能抵抗这种结构类似物，是因为被该氨基酸(或结构类似物)反馈抑制的酶的结构发生了改变(抗反馈抑制)，或者被阻遏的酶的生成系统发生了改变(抗反馈阻遏)。由于突破了原有的反馈调节系统，这些突变株就可产生大量的该种氨基酸。
　　例如选育L-精氨酸（L-Arg）高产菌株，可采用筛选结构类似物D-Argr菌株的方法（一般文献中采用上标“r”表示抗性，“s”表示敏感型）。
　　(b) 利用回复突变筛选抗反馈突变菌株　经诱变处理出发菌株，先选出对产物敏感的营养缺陷型，再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到回复突变株。筛选的目的不是要获得完全恢复原有状态的回复突变株，而是希望经过两次诱发突变，所得的回复突变株有可能改变了产物合成酶的调节部位的氨基酸的顺序，使之不能和产物结合，因而不受产物的反馈抑制。例如，谷氨酸棒杆菌的肌苷酸脱氢酶的回复突变株对其终产物鸟苷酸的反馈调节不敏感，从而提高了鸟苷酸的产量。

　　② 次级代谢产物(主要是抗生素)高产菌株的筛选。次级代谢是某些生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，次级代谢产物的合成同时还受到核外遗传物质——质粒的控制，有人将这种代谢产物叫做质粒产物。次级代谢有不同于初级代谢的特点，因此其筛选方法也和初级代谢略有不同。次级代谢产物不是菌体生长、繁殖所必需的，往往不能简单地采用筛选营养缺陷型或结构类似物抗性菌株的方法来获得高产菌株。
　　次级代谢又受到初级代谢的调节，次级代谢和初级代谢有一些共同的中间产物，这些中间产物可以进而合成初级代谢产物，也可以进而合成次级代谢产物，这取决于菌的遗传特性和生理状态，这些中间产物叫做分叉中间体。微生物的代谢调节系统趋向于平衡地利用营养物质，当环境中某些营养物质过剩，而某些营养物质缺乏时，菌体不能有效的摄入营养，在代谢调节系统作用下，菌的生长繁殖速率下降，并通过代谢途径的改变将过剩的营养物质转变成与生长繁殖无关的次级代谢产物。因此，可筛选某些营养缺陷型或初级代谢产物结构类似物抗性菌株以消除初级代谢产物对那些共同中间产物的反馈调节，使之大量积累而有利于次级代谢产物的合成。大多数菌株在被快速利用的碳、氮、磷源消耗至一定程度时才产生有活性的次级代谢酶，因此筛选解除分解代谢调节突变株，可以获得高产菌。
　　次级代谢产物高产菌株的筛选方法如下：
　　(a) 利用营养缺陷型筛选。抗生素产生菌的营养缺陷型大多为低产菌株，但是如果某些次级代谢和初级代谢处于同一分枝合成途径时，筛选初级代谢产物的营养缺陷型常可使相应的次级代谢产物增产。例如，芳香族氨基酸营养缺陷型可能增产氯霉素，芳香族氨基酸和氯霉素的生物合成途径中有一个共同的中间代谢物莽草酸，当诱变处理使莽草酸→芳香族氨基酸的生物合成出现遗传性阻碍时，菌体不能够合成芳香族氨基酸，从而避免了芳香族氨基酸对莽草酸生物合成的反馈调节，莽草酸得以大量合成，进而合成大量的氯霉素。同样的道理，脂肪酸和制霉菌素、四环素、灰黄霉素有共同的中间代谢物丙二酰CoA，脂肪酸营养缺陷型可以增产上述的抗生素。类似的例子还有头孢菌素产生菌的亮氨酸营养缺陷型可增产头孢菌素C，亮氨酸和缬氨酸有共同的中间代谢物α-酮基异戊酸，亮氨酸营养缺陷型使得缬氨酸的生成量增加，缬氨酸作为头孢菌素C合成的前体物质，参与头孢菌素C母核的合成，所以亮氨酸营养缺陷型可以提高头孢菌素C的发酵产量。一般来说，氨基酸营养缺陷不适合工业发酵生产的要求，将这种氨基酸营养缺陷型和生产菌株(或另一种营养缺陷型)杂交或者回复突变，可能得到适合于工业生产的高产菌株。因为这样的杂交后代或回复突变株，可能既保留了营养缺陷型的代谢优点(生成较多的抗生素前体)，又便于发酵生产的控制(不需要另外补充相应的营养物质)。而且，还可能通过杂交或回复突变获得具有和抗生素合成有关的基因的部分二倍体。
　　筛选渗漏缺陷型是一种值得重视的方法。所谓渗漏缺陷型(leaky mutant)是遗传性障碍不完全的营养缺陷型。突变使某一种酶的活性下降而不是完全丧失，所以这种缺陷型能够少量地合成某一代谢产物，能在基本培养基上少量地生长。由于渗漏缺陷型不会合成过多的终产物，所以不会造成反馈调节而影响中间代谢物的积累。大多数抗生素高产菌株的生长速率低于野生型菌株的生长速率，似乎可以认为它们在某种意义上属于渗漏缺陷型，生长速率降低可能有利于抗生素合成。一般文献中采用上标“-”表示营养缺陷型，上标“L”表示渗漏缺陷型，例如：Met-+ ThrL表示甲硫氨酸缺陷和苏氨酸渗漏。
　　根据以上的推理，可设计如下筛选过程：先进行摇瓶发酵试验，选出对抗生素发酵产量有明显影响的初级代谢产物，据此诱变出相应的营养缺陷型，然后再诱发回复突变或将野生型菌株诱变成另一营养缺陷型，再与之杂交。如欲筛选渗漏缺陷型，则把营养缺陷型接种在基本培养基上，这上面出现的菌落是回复突变株，其中长得特别小的菌落可能是渗漏缺陷型。
　　(b) 筛选负变株的回复突变株。选择经过诱变处理后抗生素生产能力明显降低或完全丧失，但其他性状仍近于正常的突变株作为实验材料，进行诱变，再挑选高产菌株。因为两次诱变都作用于和抗生素生物合成有关的基因上，动摇了抗生素合成的遗传基础。用此方法得到的突变株，其与抗生素合成有关的酶受调节的程度，往往低于原出发菌株。此外，从负变株中筛选回复突变株也比较容易，因为负变株没有发酵产量或发酵产量很低，便于从中检出有较高抗生素产量的回复突变株。
　　(c) 筛选去磷酸盐调节突变株。磷酸盐对许多抗生素的生物合成有抑制作用，筛选去磷酸盐调节突变株对于生产抗生素是很有意义的。因为要提高抗生素的产量，既要使生产菌生长到一定的量，又要使产生较多的抗生素。这样培养基中必须加入一定量的磷酸盐，以供菌体生长的需要，但菌体生长所需要的磷酸盐浓度往往对抗生素有抑制作用，去磷酸盐调节突变株可消除或减弱这种抑制作用以获得高产。
　　筛选能在磷酸盐抑制浓度条件下，正常产生抗生素的突变株的过程：将孢子悬浮液诱变处理后，将孢子接种于完全培养基上，使突变株得以表达，再把完全培养基上的菌落影印接种于发酵培养基(含正常浓度的磷酸盐、加琼脂)，待菌落长出后，用打孔器把长有单个菌落的琼脂块转移到一张浸有高浓度磷酸盐的滤纸上培养、发酵，然后进行生物测定。抑菌活力(抑菌圈直径／菌落直径)明显大于其他菌落的可能就是去磷酸盐调节突变株，从影印平板挑取相应的菌落，摇瓶发酵测定抗生素产量。
　　筛选磷酸盐结构类似物(如砷酸盐、钒酸盐)抗性突变株的过程：磷酸盐结构类似物对菌体结构具有毒性，其抗性菌株可能对磷酸盐调节不敏感。例如，钒酸钠是一种ATP酶的抑制剂，粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)细胞内有两种磷酸盐转运系统：一是低亲和力的磷酸盐转运系统Ⅰ，一是高亲和力的磷酸盐转运系统Ⅱ。钒酸钠抗性突变株，缺失磷酸盐转运系统Ⅱ，因而避免了过多地吸收钒酸钠而导致菌的死亡，同时也避免了过多地吸收磷酸盐而导致磷酸盐抑制。
　　(d) 筛选去碳源分解代谢调节突变株。能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时，往往对许多其他代谢途径中的酶(包括许多抗生素合成酶和其他的酶)有阻遏或抑制作用，成为抗生素发酵产量的限制因素，不利于发酵生产工艺的控制。筛选去碳源分解代谢调节突变株，对于提高抗生素发酵产量，简化发酵生产工艺具有重要意义。抗生素生产中最常见的碳源分解代谢调节是“葡萄糖效应”，葡萄糖被快速分解代谢所积累的分解代谢产物在抑制抗生素合成的同时也抑制其他某些碳、氮源的分解利用。因此，可以利用这些碳(或氮)源作为惟一可供菌利用的碳(或氮)源，进行抗葡萄糖分解代谢调节突变株的筛选。例如，将菌在含有葡萄糖(阻遏性碳源)和组氨酸为惟一氮源的培养基中连续传代后，可选出去葡萄糖分解代谢调节突变株。正常的组氨酸分解酶类是被葡萄糖分解代谢物阻遏的，如果突变株能在这种培养基中生长，说明它具有能分解组氨酸而获得氮源的酶。这样的结果，可有两种解释：一是组氨酸分解酶发生了突变，不再受到原有的分解代谢物阻遏；二是葡萄糖分解代谢有关的酶发生了突变，不再产生或积累那么多的分解代谢阻遏物。第二种解释符合许多去葡萄糖分解代谢调节突变株的特性，因为同时有许多酶(受分解代谢调节的酶)的生成都不再受到葡萄糖分解代谢物阻遏。这种现象也是在抗生素育种工作中选择这种方法筛选去碳源分解代谢调节突变株的依据。
　　葡萄糖的（毒性）结构类似物也可用于筛选去碳源分解代谢调节突变株。例如，以半乳糖作为可供菌生长利用的惟一碳源，再于培养基中添加葡萄糖的结构类似物，该结构类似物不能为菌所利用，但可抑制菌利用半乳糖。所以，在这种培养条件下，只有去葡萄糖分解代谢调节突变株能够利用半乳糖进行生长，原始菌株由于不能利用半乳糖而不能生长。因而可选出去碳源分解代谢调节突变株。筛选去碳源分解代谢调节突变株还应注意避免走向另一个极端，即片面追求葡萄糖分解代谢速率下降，因为保持合适的葡萄糖分解代谢速率是抗生素高产的关键。

图4-7　葡萄糖的（毒性）结构类似物
　　此外，筛选淀粉酶活性高的突变株，以利于在发酵培养基中增加淀粉类物质作为补充碳源，也可以减弱碳分解代谢调节对抗生素生产的抑制作用。
　　(e) 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株。许多抗生素和氨基酸有共同的前体或者有些氨基酸本身可以作为某些抗生素的前体。因此，氨基酸的代谢和抗生素合成有着密切的联系，打破菌的氨基酸代谢的调节，可能导致抗生素高产。
　　在培养基中加入氨基酸结构类似物，氨基酸结构类似物对菌的生长有抑制作用，因此可以筛选到解除了氨基酸反馈调节的突变株。这些突变株能够在含有氨基酸结构类似物的培养基中生长，抗性的机制可能在于生成较多的氨基酸，从而提高抗生素前体的量。例如，在青霉素生物合成途径中，半胱氨酸和缬氨酸是青霉素母核的前体，筛选抗半胱氨酸结构类似物或抗缬氨酸结构类似物的抗性突变株，可能提高半胱氨酸或缬氨酸的生成量，进而提高青霉素产量。又如赖氨酸和青霉素有共同的中间代谢产物α-氨基己二酸，筛选赖氨酸结构类似物抗性突变株，可以解除赖氨酸对α-氨基己二酸生成的反馈调节，使α-氨基己二酸生成量增加而促进青霉素合成。
　　筛选氨基酸结构类似物抗性突变株的方法：将菌种诱变处理，接种于含抑制浓度的氨基酸结构类似物的培养基中，由于此种培养条件使得正常菌株不能生长，而抗氨基酸反馈调节的突变株或其他抗性突变株能够生长，因此可筛选出氨基酸结构类似物抗性突变株。在实际操作过程中，有许多氨基酸结构类似物并不抑制菌的生长，或只有在高浓度时才抑制菌的生长。因此要选择合适的氨基酸结构类似物用于筛选。还有一些氨基酸结构类似物仅抑制菌落的生长和减少孢子的数量，且高浓度都不抑制菌落形成和孢子形成，在此情况下，正常大小或正常产孢子的菌落被视为抗性菌。还可以用加入抗代谢抑制剂(如多烯类抗生素)方法，使细胞膜透性增加而提高筛选效果。
　　(f) 筛选二价金属离子抗性突变株。加入能和产物(抗生素)或其中间体结合的生长抑制剂(二价金属离子)，抑制剂达到一定浓度，抗生素低产菌株不能生长而高产菌株能够幸存下来，因而可能筛选到高产菌株。抗性的机制为形成大量产物或中间体和二价金属离子结合以解除二价金属离子对生产菌的毒性。但是用此方法，细胞膜透性降低而对二价金属离子具有抗性的菌株也会存留下来，需要进一步进行摇瓶筛选，通过抗生素产量的比较去除那些并不高产的抗性突变株。
　　采用上述方法筛选出青霉素和杆菌肽等抗生素的高产菌株。杆菌肽能和二价金属离子结合，具有输送二价金属离子进出细胞的生理功能。选育杆菌肽高产菌株时，于培养基中添加适量的硫酸亚铁，在此条件下筛选到的抗性菌株多数表现出高产的特性，其可能的抗性机理是：生产菌形成大量的杆菌肽和二价铁离子结合，将二价铁离子送出细胞外，从而避免了二价铁离子对生产菌的毒性作用。
　　(g) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株。前体或前体结构类似物对某些抗生素产生菌的生长有抑制作用，且可抑制或促进抗生素的生物合成。筛选对前体或前体结构类似物的抗性突变株，可以消除前体结构类似物对生产菌的生长及其抗生素合成的抑制作用，提高抗生素产量。例如，灰黄霉素发酵使用氯化物为前体，筛选抗氯化物的突变株，提高了灰黄毒素的产量；以苯氧乙酸为青霉素前体，选用抗苯氧乙酸突变株，提高了青霉素V的发酵产量；以青霉素的前体缬氨酸、α-氨基己二酸或半胱氨酸、缬氨酸的结构类似物，筛选抗性菌株，提高了青霉素的发酵产量。
　　依据前体特性的不同，筛选抗性突变株的增产机理也有所不同。第一类前体是产生菌不能合成或很少合成的化合物，这一类前体通常需要人为地添加到发酵培养基中以促进提高抗生素产量或提高抗生素某一组分的产量。例如青霉素侧链前体苯氧乙酸、苯乙酸等，这一类前体通常对产生菌的生长具有毒性作用。对这些前体具有抗性的高产菌株可以通过高活性的酰基转移酶将前体掺入青霉素分子的侧链中，以合成青霉素，并解除前体对产生菌的毒性，使产生菌在高浓度的毒性前体存在时也能生长。筛选这一类前体的抗性突变株，应注意避免那些由于细胞膜透性下降使前体吸收减少的低产突变株或那些由于加强了对前体氧化分解的低产突变株。第二类前体是产生菌能够合成但不能大量积累的初级代谢中间产物，发酵生产中需要在发酵培养基中补充这一类前体以提高抗生素产量。例如红霉素发酵生产中添加丙醇以提高发酵产量。这一类物质过多会干扰产生菌的初级代谢而抑制菌的生长。抗性菌株的增产机理可能在于迅速将丙酸衍生物合成为红霉素，从而避免丙酸衍生物对初级代谢的干扰作用。第三类前体是初级代谢终产物，这一类前体一般对自身的抗生素合成有反馈调节作用，因而难以在细胞内大量积累。例如青霉素发酵生产中缬氨酸反馈抑制乙酰羟酸合成酶，从而抑制了缬氨酸的合成。筛选缬氨酸结构类似物抗性突变株，可使乙酰羟酸合成酶对缬氨酸的反馈抑制的敏感性减弱，促使细胞的内源缬氨酸的浓度增加而提高青霉素产量。
　　(h) 筛选自身所产的抗生素抗性突变株。某些抗生素产生菌的不同生产能力的菌株，对其自身所产的抗生素的耐受能力不同，高产菌株的耐受能力大于低产菌株。因此，可用自产的抗生素来筛选高产菌株。例如有人把金霉素产生菌多次移种到金霉素浓度不断提高的培养基中去，最后获得一株提高生产能力4倍的突变株。此方法在抗生素高产菌株选育中有广泛应用，青霉素、链霉素、庆大霉素等抗生素的产生菌均有用此方法来提高产量的例子。此方法还适用于进一步纯化高产菌株。
　　用于菌种理性化筛选的还有各种类型的突变株，如组成型突变株、消除无益组分的突变株、能有效利用廉价碳源或氮源的突变株、细胞形态改变更有利于分离提取工艺的突变株、抗噬菌体的突变株等等。这些突变株均有重大的经济价值，而且这些筛选目标虽然不以产量为惟一目标，但突变株所具有的优良特性却往往能导致产量的提高。例如红霉素生产中的抗噬菌体菌种，其红霉素产量表现出较大的变异范围，得到比原种产量高的突变株。这可能是由于发生了抗噬菌体突变后，动摇了菌种原有的遗传基础，使之更容易获得高产突变株。
　　㈤ 突变基因的表现
　　菌种的发酵产量决定于菌种的遗传特性和菌种的培养条件。突变株的遗传特性改变了，其培养条件也应该作出相应的改变。在菌种选育过程的每个阶段，都需不断改进培养基和培养条件，以鉴别带有新特点的突变株，寻找符合生产上某些特殊要求的菌株。高产菌株被筛选出来以后，要进行最佳发酵条件的研究，使高产基因能在生产规模上得以表达。例如，诱变处理四环素产生菌得到的突变株，在原培养基上与出发菌株相比较，发酵单位的提高并不明显，但是在原培养基配方中增加碳、氮浓度，调整磷的浓度，该菌株就表现出代谢速度快、发酵产量高的特性。用该菌株进行生产，并采用通氨补料的工艺来适应该突变株代谢速度快的特点，使产量有了新的突破。