偶看新闻青丘九尾狐璃儿电视剧:菌液PCR的经验_百购新闻
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/04/28 19:10:43
菌液PCR的经验
1.PCR 引物的选择（ 此点至关重要，这也是菌液 PCR 的独特魅力所在） 选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物 如： pCDNA3.0 载体： T7+ 目的基因 -R 或 SP6+ 目1.PCR引物的选择（ 此点至关重要，这也是菌液PCR的独特魅力所在）
选择一个载体上的特异性序列和一个目的基因上的特异性序列作为引物
如：pCDNA3.0载体：T7+目的基因-R
或SP6+目的基因-F
pCDNA3.1 myc his C（只有上游T7无下游SP6）：T7+目的基因-R
pEGFP（MCS两侧无通用序列）：自己设计靠近两侧的特异性引物（也可以求助于测序公司，如：上海英骏/Invitrogen，他们有绝大多数载体的测序用的引物序列）
仔细的阅读你的载体图，选择针对阳性重组子的特异性引物组合
2.菌落的处理（我用的是质粒小提，用15ml离心管摇菌，通常加5ml培养基）
挑取新鲜菌落于含抗性的（LB）培养基中
37°C 200rpm摇床 摇2-4小时以上
（通常赶时间的 话我就在摇后3小时做，这时我的PCR循环数就要相应多些，设置为32-35个循环，若不赶时间的话，我都是取摇过夜的活化菌做模板，此时我的PCR循环数就相应少些，一般28-30个循环）
3.菌液的处理
无需特殊处理菌液 或 取1-2ul菌液稀释为100倍体积，沸水浴10-15mins 甚至于在稀释体系中按1/1000加triton（这个我没做过）
提出加triton的人说这是为了破膜，以便能够释放出带目的基因的质粒，不过我觉得此步骤多次一举，细胞膜在沸水浴中肯定会变形掉
我试过沸水浴15mins，其效果和无需处理的菌液（实际上我在PCR的体系上做了手脚，后述）近似，所以后来我就没有再那么麻烦的去稀释，煮沸
4.pcr体系：无特殊要求
同普通PCR，我一般使用20ul或25ul体系，鉴定用嘛，不用太铺张，过少的体系也不推荐，除非你很信任你的“枪”和你的加样的力度
5.模板的量：1-2ul
未处理的和处理过的菌液均可以加1-2ul作为模板，需要说明的是PCR的反应是一个微量反应，用于检测10的负3-6次方级别，如果用未做任何处理的菌落来做PCR其量过于大，菌落通常都是10的6次方级别（因为我看到最近有一帖是一位仁兄直接用菌落做模板，我没有做过验证，但从原理上来说是不推荐的）
6.退火温度：55-58°C
此步我没有详细的论证，因为我的目的基因我都做过梯度PCR，其退火温度均可以用55°C或者58°C完成
T7，SP6的退火温度400-900bp的产物大概为55°
我也有62度为最佳退火温度的产物，但是用T7+目的基因-R在58°C和55°C均可以P出目的条带
7.循环数：取决于模板的拷贝数，最少的我试过28个，最多的也不过35个，均可以P出来
8.预变形时间：因为嫌稀释菌液煮沸的过程很麻烦，所以后来我就直接取的活化菌液，考虑到的确可能细胞膜变形不完全，导致扩增的模板未能完全释放，以致扩增效率降低，我将预变形的时间改为10-15mins，效果不错 ，之前煮沸过的菌液自然不需要考虑这一步