淮南市商务局:糖胶树叶中熊果酸提取物纯化工艺研究

糖胶树叶中熊果酸提取物纯化工艺研究

刘嫒姬

专 业：食品科学与工程   学号：2007464204  指导老师：刘富来

摘要：为获得天然植物熊果酸粗提物的纯化工艺，依据熊果酸在冷热乙醇中溶解度具较大的差异的特性，采用单因素与正交试验结合的热乙醇结晶法，以高效液相色谱仪对熊果酸的含量进行跟踪。结果在乙醇浓度为95%，静置温度为3℃，料液比为1:100，纯化次数为2次的条件下，熊果酸的回收率为88.2%，纯度为97%。表明热乙醇结晶法可实现糖胶树叶熊果酸粗提取物的分离纯化，所得产品纯度和收率较高，工艺简单，具工业化前景。

关键词：熊果酸；分离纯化；乙醇结晶法；高效液相色谱法

Abstract：With HPLC following the tracks of the content of ursolic acid and according to the solubility in different ethanol solutions (cold and hot), the method of single factor and orthogonal test was employed in order to find out a new technique of separation and purification of ursolic acid from leaves of Alstonia scholaris. In the circumstance that concentration of alcohol 95%, extraction temperature 3℃,ratio of solid to liquid 1∶100,and extracted for 2 times, the recovery more than 80 %,and the purity is 97%. The results showed that ursolic acid can be effectively extracted and isolated from the leaves of Alstonia scholaris with the process.

Key words: ursolic acid; extraction and purification; ethanol crystallization;HPLC

糖胶树（Alstonia scholaris）又称象皮树、灯架树、黑板树、乳木、魔神树等，属于夹竹桃科黑板树属（Alstonia），原产于高温多湿的南亚，木材的材质松软细致，全株乳汁丰富，可提取口香糖原料，故名“糖胶树”。据《云南中草药》中的记载，糖胶树叶主治感冒发热，肺热咳喘，百日咳，黄疸，胃痛，吐泻，疟疾，疮疡痈肿，跌打肿痛，外伤出血。叶含鸭脚树叶碱(picrinine)、鸭脚树叶醛碱(picralinal)、阿库阿密定碱(akuammidine)、伪阿库阿密进碱(pseudoakuammigine)、拉来宁碱(nareline)和糖胶树碱(scholarine)；另含桦皮醇(betulin)、熊果酸(ursolic acid)、β-谷甾醇及黄酮类和酚酸类化合物。

熊果酸（Ursolic acid）又名乌苏酸、乌索酸、α-香树支醇，是一种弱酸性五环三萜类化合物。熊果酸纯品为白色针状结晶（乙醇中结晶），味苦，其基本骨架是多氢蒎的五环母核，分子式C_3OH₄₈O₃，分子量456.68，熔点285～287℃，不溶于水和石油醚，易溶于二氧六环、吡啶、乙醇和甲醇。熊果酸在自然界分布很广，主要分布在女贞子、山楂、夏枯草等植物中^[1]。近年来的研究表明 ,熊果酸具有多方面的药理作用，它对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌均有活性，还有抗溃疡、镇咳、抗癌作用，可以抗突变、抗氧化和诱导癌细胞的分化^[2]。其具有毒性小、抗肿瘤活性强的特点^[3],所以熊果酸是一种很有开发价值的植物活性成分，极有可能成为低毒有效的新型抗癌药物。

目前关于熊果酸提取方面的报道已有很多，有采用超声波提取、溶剂提取、超临界萃取等提取活性成分，并认为这些方法在熊果酸提取方面已经显示出一定的优势^[4-10]。分离纯化熊果酸工艺，其中一种是将乙醇提取液减压浓缩后用有机溶剂萃取，如氯仿、二氯甲烷、丙酮、苯等，该工艺成本高，涉及有毒有害试剂；另一种方法是将提取液减压浓缩，用硅胶柱或交联葡聚糖凝胶柱分离富集，采用该工艺，柱填料成本高，工艺过程复杂，并且常用有毒有机溶剂作洗脱剂污染环境^[11]。目前对熊果酸的药理药效研究较多^[14-17] ,但对其提取纯化工艺的研究较少。为了探知更安全的，效果更佳的从天然植物中提取纯化熊果酸的工艺流程，本文在前期充分研究的基础上，依据熊果酸在冷热乙醇中溶解度具较大的差异的特性，采用单因素与正交试验结合的重结晶方法，并用高效液相色谱仪对熊果酸的含量进行了跟踪。此工艺研究为生物活性物质的进一步纯化、精制提取提供了基础，具有了一定的实际应用意义。

1 材料与方法

1.1、材料与仪器

1.1.1材料

①糖胶树叶（采自佛山市禅城区惠景公园）用清水漂洗干净，去除灰尘和泥沙，然后在50℃烘干至恒重，粉碎备用；

②95%乙醇、甲醇，氢氧化钠、硫酸等，均为分析纯，甲醇（色谱纯）；

③熊果酸标准品，购于上海同田生物有限公司，纯度为＞98%，批号为06112320。

1.1.2仪器

电热恒温水浴锅（长沙市红声电器厂）；TE412-L万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；LC-20AProminence(岛津国际贸易有限公司)；色谱柱：Ultimate^TMXB-C18,5um，4.6*150mm （Welch Materials）；检测器：二极管阵列检测器（SPD-M20A）(岛津国际贸易有限公司)；柱温箱：CTO-20A(岛津国际贸易有限公司)；高压泵:LC-20AD泵(岛津国际贸易有限公司)；101-2电热干燥箱（金坛市科析仪器有限公司）；电子万用炉（北京市永光明医疗仪器厂）；水浴回流装置；抽滤装置。

1.2、试验方法

1.2.1熊果酸提取方法

称取糖胶树叶20g，利用碱提酸沉的原理，本实验依次用碱液作提取剂，酸液作沉淀剂，得到熊果酸沉淀物，熊果酸沉淀物用95%的乙醇洗3次，过滤后将滤液烘干，即得到熊果酸粗产品。提取基本条件为：提取次数为3次，料液比为1：10，碱的质量分数为20%，酸的体积分数为15%。粗提物可先经一定量的活性碳处理除杂除色，可以提高纯化效果。本实验已由本校食品05级潘带卿毕业设计得出最佳提取工艺条件为：提取次数为3次，料液比为1：10，碱的质量分数为20%，酸的体积分数为15%。在该条件下，熊果酸的提取率为90.33%，纯度为95.66%。

1.2.2 熊果酸乙醇结晶纯化法

分别称取5.0g熊果酸粗品(中山大学测试中心测定为66.8%的熊果酸样品)，将样品置于锥形瓶中，在水浴85℃下，用95%乙醇按料液比1：110水浴回流至熊果酸全部溶解，保持沸腾30min，配制成过饱和溶液，此时溶液呈澄清透明，即可撤去水浴加热，常压过滤后，滤液在5℃温度下静置7天后（可用玻璃棒摩擦瓶壁，以形成粗糙面或玻璃小点作为晶核，使溶液分子呈定向排列，促使晶体析出），将其结晶物减压过滤至干燥，称重，用高效液相色谱仪测定其含量。

1.2.3熊果酸的含量测定

1.2.3.1色谱条件

色谱柱为C-18色谱柱（Ultimate^TMXB-C18, 5um，4.6*150mm）；流动相乙腈：水=93：7；流速为1.0mL/min；检测波长为210nm；柱温为35℃；进样量10uL。

1.2.3.2标准溶液的配制

精密称取2.7mg熊果酸对照品，用甲醇定容于10mL定容瓶中，摇匀，制得浓度为0.27mg/mL的熊果酸贮备液。精确吸取熊果酸贮备液2mL、4mL、6mL、8mL分别置于10mL容量瓶中，用甲醇定溶至刻度，摇匀，制得浓度为0.054 mg/mL、0.108 mg/mL、0.162 mg/mL、0.216 mg/mL熊果酸对照品溶液。

1.2.3.3供试品溶液制备

精密称取样品干燥粉末3-5mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定溶至刻度，过滤，摇匀，作为供试品液。

1.2.3.4标准曲线的制备

在上述色谱条件下，将以上各浓度的对照品溶液分别进样10uL进行测定。以熊果酸含量（X）作横坐标，峰面积积分值（Y）作纵坐标绘制标准曲线，得到熊果酸的线性回归方程为：Y=4693210X+5767（R=0.9970）。结果表明，熊果酸的进样量在0.054-0.216 mg/mL范围内，峰面积与样品浓度之间呈良好线性关系。

1.2.3.5 样品的测定

样品在与标准曲线相同的色谱条件下测定，根据回归方程得到样品中熊果酸的浓度。

1.3单因素实验

1.3.1 乙醇浓度对熊果酸纯度的影响

分别称取5.0g熊果酸粗品，在水浴85℃下，用70%、75%、85%、90%、95%乙醇浓度按料液比1：110水浴回流直至熊果酸全部溶解，沸腾30min，配制成过饱和溶液，此时溶液呈澄清透明，即可撤去水浴加热，用常压过滤后，滤液在5℃下静置7天，将其沉淀结晶减压过滤至干燥，称重，用高效液相色谱仪分别测定其含量，考察乙醇浓度对熊果酸纯度的影响。

1.3.2静置温度对纯化熊果酸的影响

分别称取5.0g熊果酸粗品，在水浴85℃下，95%乙醇浓度按料液比1：110水浴回流直至熊果酸全部溶解，保持沸腾30min，配制成过饱和溶液，此时溶液呈澄清透明，即可撤去水浴加热，用常压过滤后，滤液分别在0℃、3℃、5℃、8℃、10℃下静置7天，将其沉淀结晶物减压过滤至干燥，称重，用高效液相色谱仪测定分别其含量，考察静置温度对熊果酸纯度的影响。

1.3.3 料液比对纯化熊果酸的影响

分别称取5.0g熊果酸粗品，在水浴85℃下，95%乙醇浓度按料液比1：50、1：80、1：110、1：140水浴回流直至熊果酸全部溶解，保持沸腾30min，配制成过饱和溶液，此时溶液呈澄清透明，即可撤去水浴加热，用常压过滤后，滤液在5℃温度下静置7天，将其沉淀结晶物减压过滤至干燥，称重，用高效液相色谱仪分别测定其含量，考察料液比对熊果酸纯度的影响。

1.3.4 纯化次数对纯化熊果酸的影响

分别称取5.0g熊果酸粗品，在水浴85℃下，95%乙醇浓度按料液比1:110水浴回流直至熊果酸全部溶解，保持沸腾30min，此时溶液呈澄清透明，即可撤去水浴加热，用滤纸过滤后，滤液在5℃下静置7天，将其沉淀结晶物抽滤至干燥，称重，再取结晶物分别重结晶1、2、3次，用高效液相色谱仪分别测定其含量，考察料液比对熊果酸纯度的影响。

1.4、正交试验设计

由单因素实验结果分析中可以看出，乙醇浓度、静置温度、料液比、纯化次数这四个因素对熊果酸的纯度和回收率有着不同程度的影响。因此，正交试验主要考察这四个因素的不同水平下的组合对回收率和纯度的影响，具体的水平选择见表1。

表1 正交试验因素与水平表

因素

A乙醇浓度（%）

B静置温度（℃）

C料液比

D纯化次数

水平

85

3

1：90

1

90

5

1：100

2

95

8

1：110

3

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果分析

2.1.1乙醇浓度对熊果酸纯度的影响

图1 乙醇浓度对纯化熊果酸的影响

从图1可以看出：乙醇浓度95%时熊果酸的纯度最高，但回收率随着乙醇浓度的提高而下降，是由于有更多的杂质被溶解于95%乙醇中不被重新析出，所以此时析出的熊果酸晶体纯度高，得率低。由于在乙醇浓度85%时，在热过饱和溶液常压过滤过程中有较多熊果酸粉末析出，造成在未形成结晶前就有较多的熊果酸损失，使熊果酸晶体得率降低。因此，综合考虑这些因素的影响，确乙醇浓度在95℃左右较好。

2.1.2静置温度对纯化熊果酸的影响

从图2可以看出：在0℃温度下纯度最高，5℃下回收率较高。在一定温度范围内，随着温度降低，有利于结晶体的形成，温度的提高，结晶体的形成缓慢。由于在冷冻过饱和溶液时，当温度降低时，熊果酸溶解度也会降低，而且在低温下迅速冷却的情况下，会析出很小的结晶颗粒，小晶体包括杂质少，纯度较高，但晶体得率较少。因此，综合考虑这些因素的影响，确定静置温度在5℃左右较好。

图2 静置温度对纯化熊果酸的影响

2.1.3料液比对纯化熊果酸的影响

从图3可以看出：当料液比从1：50-1：110的时候，纯度是不断提高的，但到了1：140时，纯度却逐渐下降了。回收率则随着料液比的增加而不断的下降，到了1：140时，得率几乎为0。由于在结晶过程中，溶剂过量会造成溶解损失，而溶剂过少则会给热过滤带来麻烦，可能造成更大的损失，因此把握适当的料液比，是得到比较纯的产品和比较好的收率的重要条件。因此，综合考虑这些因素的影响，确定静置温度在1:110左右较好。

图3 料液比对纯化熊果酸的影响

2.1.4纯化次数对纯化熊果酸的影响

图4 纯化次数对纯化熊果酸的影响

从图4可以看出：随着重结晶次数的增加，熊果酸的纯度越来越高，但是随着重结晶的次数的增加，熊果酸回收率越来越低。晶态物质在一再结晶过程中，结晶的析出总是越来越快，纯度也越来越高。这是由于在多次结晶后，晶态物质中所含杂质越来越少，有利于化合物晶核的形成和结晶体的生长。因此，综合考虑这些因素的影响，确定纯化次数在2次左右较好。

2.2正交实验结果分析

由表2可知，熊果酸纯度：A₂>A₁>A₃，B₃>B₁>B₂，C₃>C₂>C₁，D₂>D₃>D₁，从R极差来分析，影响纯化因素的主次顺序为D>C>B>A，即纯化次数>料液比>静置温度>乙醇浓度。直观分析表明，在A₃B₁C₂D₂（即乙醇浓度为95%，静置温度为3℃，料液比为1:100，纯化次数为2次）条件下，熊果酸的纯度最高，属最佳条件。

从表3正交结果方差分析结果可知，显著因素的顺序排列为：纯化次数>静置温度>料液比，纯化次数是最显著的影响因素，纯化次数越多，越能提高熊果酸的纯度，但回收率会逐渐降低，原因是除去了更多的杂质，结合单因素以及直观分析来看，当纯化次数为2次时，熊果酸的纯度达到了90%以上，回收率比纯化次数为3次时高，而乙醇浓度的影响不显著，对熊果酸的影响较小，结合乙醇浓度单因素来看，乙醇浓度为95%时熊果酸浓度为最高的，因此最优取A₃（乙醇浓度为95%），D₂（纯化次数为2次）。静置温度和料液比对熊果酸的纯度的影响也是显著的，结合直观分析，因此最优取B₁（静置温度为3℃），C₂（料液比为1：100）。因此，最佳纯化工艺条件为A₃B₁C₂D₂,即乙醇浓度为95%，静置温度为3℃，料液比为1：100，纯化次数为2次。在该条件下，熊果酸的回收率为88.2%，纯度为97%。

表2 熊果酸纯度和回收得率的正交试验与分析

序号

A

B

C

D

纯度（%）

回收率（%）

1

A1

B1

C1

D1

64

49.6

2

A1

B2

C2

D2

78

39.7

3

A1

B3

C3

D3

80

23.2

4

A2

B1

C3

D3

70

56.4

5

A2

B2

C1

D1

66

42.3

6

A2

B3

C2

D2

88

26.1

7

A3

B1

C2

D2

97

88.2

8

A3

B2

C3

D3

56

44.7

9

A3

B3

C1

D1

67

32.2

纯

度

（%）

K₁

74

77

69.333

65.667

T=887.001

K₂

74.667

66.667

71.333

87.667

K₃

73

78

81

68.667

R

1.667

11.333

11.667

22.334

表3 正交结果方差分析

      因素名称

SS

df

MS

F

Fa

显著性

纯

度

（%）

乙醇浓度

4.2222

2

2.1111

1

F(0.05)=19

静置温度

236.2222

2

118.1111

55.9474

*

料液比

233.5556

2

116.7778

55.3158

*

纯化次数

870.8889

2

435.4444

206.2632

*

误差

4.2222

2

2.1111

总变异

1344.8889

注：*代表因素有显著的差异性，**代表因素有极显著的差异性。

3 讨论

以乙醇为熊果酸的纯化溶剂，是因为乙醇的极性与熊果酸相近，溶解度大，而且乙醇为毒的低机溶剂，不会污染环境，为开发无毒的熊果酸的提取工艺提供了理论依据。本工艺采用单因素与正交试验结合的热乙醇重结晶纯化方法，以高效液相色谱仪对熊果酸的含量进行跟踪，能不断完善提取工艺，可以作为研究从天然植物中纯化熊果酸的有效方法。

4 结论

4.1本工艺采用单因素与正交试验结合的热乙醇重结晶纯化方法，以高效液相色谱仪对熊果酸的含量进行跟踪，能不断完善提取工艺，可以作为研究从天然植物中纯化熊果酸的有效方法。

4.2通过单因素试验和正交试验研究了糖胶树叶提取物熊果酸的纯化工艺，确定了最佳工艺条件。各因素对熊果酸纯度影响程度大小依次为：纯化次数>料液比>静置温度>乙醇浓度。最佳工艺条件为乙醇浓度为95%，静置温度为3℃，料液比为1：100，纯化次数为2次。在该条件下，熊果酸的回收率为88.2%，纯度为97%。

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