偶看新闻常德淮阳中学彭放:DNA/RNA的定量与纯度的测定 - LCC的日志 - 网易博客
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/05/01 02:55:57
DNA/RNA的定量与纯度的测定
生物学实验 2009-05-13 22:01:29 阅读1231 评论0 字号：大中小
一、实验目的
学习、掌握紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理和方法。
二、实验原理
DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在280nm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在230nm处。因此，可以用260nm波长进行分光测定DNA浓度，OD值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。如用1cm光径，用 H2O稀释DNA/RNA样品n倍并以H2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：DNA（mg/ml）=50×OD260读数×稀释倍数/1000。RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数/1000。
DNA/RNA纯品的OD260/OD280为1.8或2.0，故根据OD260/OD280的值可以估计DNA的纯度。若比值较高说明含有RNA，比值较低说明有残余蛋白质存在。OD230/OD260的比值应在0.4-0.5之间，若比值较高说明有残余的盐存在.本实验室机器显示是OD260\OD230，则比值应在2-2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。
三、实验步骤
1. 将制备的DNA悬浮溶解于TE缓冲液中[pH8.O, 1Ommo1/L的Tris缓冲液,内含〈1mmol/L EDTA〉]或悬浮溶解在灭菌水中(依据DNA含量加水)。
2. 用可扫描的紫外分光光度计测定制备的DNA/RNA的紫外吸收曲线，测定OD260和OD280，并计算比值：OD260/OD280，纯DNA的此比值约为1.8～2.0。纯RNA的此比值约为大于2.0。
3. 根据：每毫升1微克的纯DNA的OD260值= 0.020，计算所得DNA的纯度；
每毫升1微克的纯RNA的OD260值= 0.025，计算所得RNA的纯度；
并讨论纯度较低的原因和解决办法。
260、320、230、280nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，只看OD260/OD280（Ratio，R）。
DNA: OD260/OD280比值应接近1.80，若R值大于1.8。说明存在RNA，可重新用RNaseA处理,酚:氯仿:异戊醇(23:24:1)抽提。若R值小于1.8，则说明有蛋白质等杂质存在，需再用蛋白酶K、SDS及盼、氯仿、异戊醇重新对DNA进行纯化（也可加入1/8体积的3M NaAc(pH5.2)与冷乙醇一同促使DNA沉淀析出。
RNA: OD260/OD280比值在1.8-2.0时，认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
注意事项
1. 有用品均需要高温高压，以灭活残余的DNA酶/RNA酶。
2. 所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制，RNA均用DEPC处理的水。
3. 用大口滴管或吸头操作，以尽量减少打断DNA的可能性。