偶看新闻贵阳观山湖区立新小学:总mRNA的提取（自己的经验）：摘自生物在线
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/05/05 05:39:46
一、 关于Trizol Reagent需要的试剂
1． Chloroform：氯仿（分析纯）
2． Isoproplyl alcohol：异丙醇（分析纯）
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）：75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4． RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃ 3小时）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 关于Trizol Reagent的使用过程：
1． Homogenization（匀浆）
a. Tissues：组织
每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
1） 组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。
（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。
（3） 4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。
（4） 仔细吸取上层水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。
（6） 4℃离心，10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。
（7） 弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无 Rnase dH2O中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保存备用。
RNA定量：
RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较 不同标本之间就更不准了。
RNA的贮藏，最主要的是温度，－20不够，最好－80，液氮最保险。
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响。
防止RNA酶污染的措施：
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
1． Chloroform：氯仿（分析纯）
2． Isoproplyl alcohol：异丙醇（分析纯）
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）：75%乙醇。要求用分析纯无水乙醇并用0.01%的DEPC处理过的无Rnase的水稀释。
4． RNase-free water：无Rnase的水。方法是：将DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃过夜，并高压灭菌即得（150℃ 3小时）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 关于Trizol Reagent的使用过程：
1． Homogenization（匀浆）
a. Tissues：组织
每100mg组织匀浆加1mlTrizol试剂，样品体积不能超过Trizol试剂的10%。
1） 组织接入预冷的EP管中，加入Trizol试剂1ml/10cm2（量一定要加足，否则易污染），混匀，吹吸几次，以破裂细胞，置室温5min，以使核蛋白复合物彻底分离。
（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol试剂加入氯仿0.2ml），盖好，剧烈震荡15s，置室温2-3分钟。
（3） 4℃离心，10000g×15min，离心后，混合物将分离为底层为浅红的、中层为酚-氯仿相、上层为无色的水相。RNA包含在水相中，水相的体积约相当于所加的Trizol试剂量的60%。
（4） 仔细吸取上层水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml异丙醇，以沉淀RNA（每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇），置室温10min。
（6） 4℃离心，10000g×10min。RNA沉淀为一层如凝胶样透明的小块附在管底和管壁。
（7） 弃上清液，加入预冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol试剂加入75%乙醇至少1ml），震荡，充分洗涤沉淀，4℃离心，5500g×5min。弃上清液，空气干燥（或真空干燥）后，沉淀重悬于无 Rnase dH2O中，吹吸几次，55℃-60℃作用10分钟以溶解RNA，-70℃保存备用。
RNA定量：
RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较 不同标本之间就更不准了。
RNA的贮藏，最主要的是温度，－20不够，最好－80，液氮最保险。
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响。
防止RNA酶污染的措施：
1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。
3. 有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。
4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
6. 设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。
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