桓仁县招聘信息:细胞划痕实验

很多战友肯定现在都做过关于细胞迁移的实验。
其中划痕法以其材料廉价，操作简单而多年来一直深受大家的欢迎。

我这里介绍一下我自己的操作过程和结果图。希望能给新来的战友们以帮助。

材料：
6 孔板（其他的也可以，但感觉6孔比较好，大小适中）
marker笔
直尺
20微升枪头（灭菌）
无血清培养基
PBS

准备：
所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）

流程：
1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。
2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。
3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。
4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。
5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。

下面是照片，细胞NIH3T3
0h


6h NIH3T3


12h NIH3T3


24h NIH3T3


最后，欢迎各位正在奋斗的战友过来一起讨论，同时，申请版主加分：）
楼主的照片很漂亮但是用六孔板我觉得有些浪费，我们实验室常用的是96孔板，可以同时做很多平行复孔。不知你照片拍完了之后用什么软件统计划痕的宽度呢，我们一般使用共聚焦显微镜自带的软件。你能把统计方法介绍一下吗？
老实说，我们实验室没有什么好的软件。所以一般只作定性，不作定量。
如果楼上有好的软件能否共享一下，不胜感谢。
6空板可以保证有相当距离的平直划痕，我觉得挺不错的。而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，不作重复，误差也很小。
细胞迁移实验是做什么研究的啊，不是很懂
感谢，学到宝贵经验！
谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。

需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。

照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。
恩,学习了不少,

tacthgin wrote:
谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。

需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。

照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。

谢谢。无血清的话，应该一个细胞周期内，增殖可以忽略吧。而且我定点监测的话，差不多可以对应到每个细胞。好像没有看见很明显的增殖现象。丝裂霉素貌似很贵的说。。。如果用这个还不如直接用transwell呢。
另，image J 哪里有下载么？谢谢。
ImageJ 下载网址：http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html

无血清培养，确实细胞增殖可以忽略了，不过由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。不知道是不是大多数文献都用无血清培养状态下作划痕实验呢？你这不是“又叫马儿跑，又叫马儿不吃草么“。呵呵

tacthgin wrote:
ImageJ 下载网址：http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html

无血清培养，确实细胞增殖可以忽略了，不过由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。不知道是不是大多数文献都用无血清培养状态下作划痕实验呢？你这不是“又叫马儿跑，又叫马儿不吃草么“。呵呵

谢谢，tacthgin战友的提醒，确实存在这个问题。所以目前最好的方法还是transwell法。
一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（《2%）否则细胞增殖就不能忽略。一般认为细胞周期是24小时，但对于一些特殊的细胞系来说，生长可能会快一点。因此好像还没看见用带血清培养，短时间检测的。不过我会去试试看。可能是个好方法。
划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。）
划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为
1。这些细胞本身有迁移能力，且较强。
2。细胞有极性，方便测量，观察。
3。细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。

另：在此贴出的图片都是本人实验数据，非将本人同意不得转载，引用。如需要引用者，请同本人联系协商。

一下是一种上皮样细胞的48小时监测图。可以看到划痕已近弥合。


现在好多SCI杂志都不认这个实验了，
要求做transwell了。
这个方法无法进行精确定量，前期做起来容易，后期数据处理比较麻烦，还得附图，SCI杂志照片之昂贵，远超过了transwell的价格。
　
Photoshop 6.0以前的版本有个直方图的功能可以直接反映选择区域的象素多少，用来做面积分析应当很好用，用于做划痕修复的实验应当也很好用，当然，有更专业的Image Pro Plus的话PS就没必要了。

wuushark wrote:
现在好多SCI杂志都不认这个实验了，
要求做transwell了。
这个方法无法进行精确定量，前期做起来容易，后期数据处理比较麻烦，还得附图，SCI杂志照片之昂贵，远超过了transwell的价格。
　

本人正打算投稿呢，其中就包括划痕实验，能否请wuushark 指点一下哪些SCI杂志不认这个实验呢？

我个人认为选择scratch assay 或者是 transwell assay 是根据所研究的细胞系的特点来决定的。
上皮细胞，癌细胞，角质细胞，在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，scratch assay 很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。
neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell, 这类细胞在生理状态下并不形成monolayer, 病理状态下的细胞迁移是在细胞因子或趋化因子的影响下在基质中纵向运动，transwell assay 模拟了这种运动形式，是适合的模型。

tacthgin wrote:
本人正打算投稿呢，其中就包括划痕实验，能否请wuushark 指点一下哪些SCI杂志不认这个实验呢？

我个人认为选择scratch assay 或者是 transwell assay 是根据所研究的细胞系的特点来决定的。
上皮细胞，癌细胞，角质细胞，在生理状态下，形成单层或者复层上皮，当病理状态下，比如创伤愈合，细胞迁移的时候，以侧向运动为主，scratch assay 很好的模拟了这种运动形式，是很好的模型。
neutrophil, monocyte/macrophage, mesenchymal stem cell, 这类细胞在生理状态下并不形成monolayer, 病理状态下的细胞迁移是在细胞因子或趋化因子的影响下在基质中纵向运动，transwell assay 模拟了这种运动形式，是适合的模型。

非常同意，tacthgin战友的思想。其实在伤口弥合中，fibroblast的向创口处迁移就是典型的侧向爬行。但是其实癌细胞的迁移倒不是侧向爬行那么简单，我觉得应该是综合效应，而且要看是什么类型的肿瘤。因为对于远端病灶的转移，显然是通过血液运输的。这是一个细胞去黏附和再黏附的过程。其实transwell也不能很好的模仿这个过程。只是transwell matrigel可以模仿肿瘤细胞融解基质，侵入到正常组织的这个过程。也就是侵袭。所以对于做cancer的来说，可能transwell会更好些。但我觉得并不能就简单否定scar assay。细胞的迁移作为细胞的一个正常生理活动，是表征细胞生理变化的一个重要指标。这点是很主要的意义。
不错！

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