偶看新闻蜂组词有哪些:Ti载体
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/04/27 23:17:55
经限制性酶酶切的DNA片段或基因，不能直接进入宿主细胞进行克隆的。一个DNA片段只有与适合的载体(vector)DNA链接构成重组DNA分子，才能进入宿主细胞(host cell)，并在其中复制、扩增,克隆出多个拷贝。
可作为DNA载体的有质粒,噬菌体,病毒,细菌或酵母菌人工染色体BAC,HAC等。现在使用的各种载体都是用基因工程方法构建的。作为载体DNA 分子,需要具备以下4个条件:
①具复制原点(ori),在宿主细胞中不仅能独立地自我复制,而且能带动携带的外源DNA片段一起复制。
②具有多个克隆位点(multiple cloning site,MCS,或称polylinker region),即具有多种限制性酶的切点,而每一种酶的切点只有一个,用于克隆外源DNA 片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内,以保持载体的自主复制特性及表型标记性状。
③至少具有一个选择标记基因,这个基因通常是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因,而宿主细胞则没有这种基因,使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。
④易从宿主细胞中吸收。
㈠细菌质粒
质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的,能自我复制,易分离和导入的环状双链DNA分子。早期用于基因工程的载体是遗传改良的细菌质粒,他们仅能用于克隆分子量小于10Kb(1000bp=1kb)的外源DNA片段。这些质粒的适应范围广,拷贝数多。尽管在转化时仅一个质粒进入宿主细胞,但复制之后每个细胞的质粒拷贝数可高达1000个。这一特点十分有利于大量扩增克隆的DNA的片段,作为克隆载体应用。
现在广泛使用且商品化的质粒,很多都具有重组表型检测标记,在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段。例如pUC18质粒(图9-3)就具有以下特点:①分子量小(2.69kb),也可以接受较大的外源片段。②拷贝数多,在每个宿主细胞的拷贝数可达500个;③多克隆位点的酶切位点多,克隆方便;④具有α-互补显色表型,可作为检测重组质粒存在于否的选择标记。 α-互补是指来自细菌DNA的lacZ酶(β-半乳糖苷酶)N端的一段氨基酸残基(α-肽),在与α-肽缺失的酶混合后(体外或体内),能恢复lacZ酶的活性的一种基因内互补现象。pUC系列的载体就是利用这一特点而设计的。如图9-3所示, pUC18质粒带有细菌DNA lacZ基因启动子,操纵子,调节基因以及lacZ 基因α-肽(N端的146个氨基酸),在lacZ 基因内插入了一个多克隆位点,这段序列与lacZ在同一个阅读框架内。 pUC18表达的α-肽具有多克隆位点的18个氨基酸残基,仍具有α-互补功能。因此,将pUC18质粒转入带有lacZ 基因α-肽缺失的宿主细菌细胞内后,在含有5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷(5-bromo-4-chhloro-3-indoly-β-galactopyranoside,)及IPTG的培养基上,质粒产生N端的146个氨基酸,宿主菌产生C端的氨基酸,经α-互补可产生有功能的lacZ酶,水解X-gal产生一种兰色物质,附着于细菌细胞上使菌落呈兰色。当在多克隆位点插入一个外源DNA片段时,破坏了α-肽的阅读框架,或导入转录或翻译终止信号,使α-肽不能正确表达,仅宿主细菌产生的C端氨基酸没lacZ 基因有lacZ 酶活性,结果在上述同样培养条件下,形成的菌落呈白色。所以白色菌落即是带有外源DNA片段的阳性克隆。
㈡λ噬菌体
λ噬菌体基因组全长49kb,其核酸序列及基因功能和表达调控已研究的十分清楚。 λ噬菌体的DNA中间约2/3的序列位中间基因 (central gene cluster),位于两端的位DNA 左臂和右臂。研究表明, λ基因组的中间基因序列可被外源DNA 片段取代,而不影响噬菌体感染细菌及形成噬菌斑的能力。根据这一特点,在改造利用λ噬菌体做载体时,在两个臂于中间基因链接导入处导入限制性酶切点(如EcoR Ⅰ),酶切λDNA后分别得到两个臂(lambda arms),再将经同一种酶酶切的外源DNA片段与两个臂链接构成重组DNA分子(图9-4)。形成的重组DNA分子用噬菌体蛋白包装提取物体外包装(in vitro packaging)后,经转导感染具有适宜基因型的宿主细菌菌株,噬菌体再在细菌细胞内繁殖,扩增,在平板培养基上形成噬菌斑。然后据噬菌斑的形态或显色表型(α-互补,如M13系列载体),即可鉴定出阳性克隆。
λ噬菌体载体可接受15~30kb的外源DNA片段,他既可作为克隆载体,也可作为表达载体,用作cDNA(如λgt10,λZAPⅡ0或核DNA(如EMBL3,GEM12)克隆的载体。在基因库筛选中, λ噬菌体作载体与细菌质粒相比,具有易操作,阳性克隆数多等特点,现广泛用于各类基因库的构建。
㈢柯斯质粒
柯斯质粒(cosmid)是利用部分λ噬菌体DNA与部分细菌质粒DNA序列组建而成的(图9-5)。柯斯质粒具有λ噬菌体的cos序列(12bp)细菌质粒的复制原点。cos序列是噬菌体DNA包装成噬菌体时所必需的,而质粒的复制原点可使柯斯质粒在细菌细胞中同普通细菌质粒一样自主复制。柯斯质粒也具有抗生素抗性基因。
尽管这种质粒的分子量较小,但他可接受长达50kb的外源DNA片段,这在克隆真核生物基因中十分有用,因为一个DNA 片段就可能具有真核生物基因的编码序列及其他调控序列。柯斯质粒不仅直接用于真核生物基因的分离与克隆(见下面YAC载体)系统结合,用于基因作图分析。
㈣穿梭载体
穿梭载体(shuttle vector)是指能在两种不同的生物中复制的载体。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。因此,这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因,还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状,具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因,在酵母菌中用于基因表达分析。
酵母菌的Yep系列载体(图9-6)以及Yip。Ycp和Yrp系列载体均是穿梭载体。Yep为酵母菌附加体质粒,他的ARS序列来自酵母菌内源附加体2μ,可使每个细胞的拷贝数保持在100个左右。Yep还具有2μ的两个顺式调空元件,质粒分配序列和2μ调空元件。这两个元件可使在细胞分裂中各细胞分配的质粒数相近, 2μ序列不断扩增。Yep的Amp和四环素(Tc)抗性用于细菌中选择,而URA3(尿嘧啶)基因用于在酵母菌中选择。Yep24具有Amp及Tc两个抗生素抗性基因,可将外源DNA片段插在抗生素基因中,通过插入失活,选择阳性克隆。尿嘧啶营养缺陷型菌株URA3-不能合成尿嘧啶,在不含附加尿嘧啶的培养基中不能生长。将带有URA3基因的Yep转化为URA3-酵母菌菌株后,阳性克隆可在不含附加尿嘧啶的培养基上生长,而非阳性克隆则不能生长。很多酵母菌的穿梭载体,用于功能互补法分离和鉴定真核生物基因的研究。
㈤细菌人工染色体
在进行真核生物基因组的分析及作图中,发现上述的集中载体都不能携带大于50kb以上.细菌人工染色体(BAC)载体就是为了克隆大的外源DNA片段而设计构建的。
BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。如第6章所述,F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒,约100kb,同时能在细菌接合时专一1000kb 的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体,可用于克隆100kb以上的DNA片段。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝,这一特点有利于保持DNA大分子,尤其是重复序列多的大分子,在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小,如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb(图9-7),仅带有自我复制，控制拷贝数(repE)及质粒(parE,parA,parB)所必须的最少序列。这些基因均来自F因子。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因以及多克隆位点。在pBeloBAC11中,多克隆位点lacZ基因内,因此可采用选择pUC18阳性重组子的方法,即α-互补显色法选择阳性BAC重组子。此外,在多克隆位点两侧,还有T7及SP6启动子位点,用于制备RNA分子,进一步分析克隆的基因表达,作为染色体步行的探针,以及序列测定克隆的片段。
㈥酵母人工染色体
酵母人工染色体(YAC)是与前述的穿梭载体不同的另一类酵母菌穿梭载体。他是人类在对酵母菌生物学,遗传学的基本特征深入研究的基础上,结合穿梭质粒Yep的一些特点构建而成。YAC也是为适应真核生物基因组分析而发展起来的。1996年酵母菌基因组全部序列已经测定,为分析YAC克隆提供了直接依据。将来自YAC克隆的序列与酵母菌基因组序列比较,即可以完全排除重组YAC载体来自酵母菌DNA的可能性。
同YAC载体一样，YAC也具有自主复制序列、克隆位点以及可在细菌和酵母菌中选择的标记基因。此外，YAC还具有酵母菌染色体的一些特点。YAC可以接受100~1000kb 的外源DNA片段，这一特点使YAC成为人类基因组计划及图位克隆分离基因的重要工具，并促进了发展人类人工染色体（human artificial chromosome，HAC） 的研究。
目前应用最多的YAC载体是PYAC4(图9·8)，这个载体具有以下主要结构:①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因);②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4);③一个自主复制序列(ARS1); ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列 (TEL),以保持重组YAC为线状结构;⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff, HIS3)，以便PYAC4在细菌细胞中稳定扩增;⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点;⑦一个EcoR Ⅰ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。Sup4 基因编码赭色抑制tRNATYR，抑制赭色表型 (成为白色)。如果用不含外源DNA片段的PYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源DNA片段的PYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用，大大简化了阳性克隆工作。
在利用PYAC4载体克隆时，要将PYAC4载体线性化，分离纯化带有染色体末端序列的两个臂，同时分离纯化大分子DNA片段，连接后用于转化酵母菌感受态细胞。
[七]Ti质粒及其衍生载体应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物系统，才能将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由Ti质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导入植物细胞的植物表达载体。
Ti质粒是一种细菌质粒 (图9-9)，它自然存在于一种革兰氏阴菌——根瘤土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）细胞中。根瘤土壤杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤。植物产生的这种根瘤细胞与动物的癌细胞 (tumor)相似，它们能独立地、不受控制地生长。根瘤细胞的形成是因为根瘤土壤杆菌中存在着一种诱导瘤细胞 (tumor-inducing，Ti)的质粒，这种质粒被称为Ti质粒。Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA（transferDNA，T-DNA）， DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱 (opine)，作为根瘤土壤杆菌的碳源和氮源。
1．Ti质粒的特点利用缺失、突变、转座及互补等方法对Ti质粒的研究，发现Ti质粒具有以下特点:
(1) Ti质粒具有5个主要功能区域 (图9-9)。它们分别是T-DNA、质粒转移 (plasmid transfer)、冠瘿碱代谢 (opine catabolism)、复制原点 (oir)和毒性区域 (vir)。
(2)T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其他序列交界处的25bp不完全直接重复 (imperfect direct repeat)，右端的这段序列称为右界 （right border，RB），左端的序列称为左界 (left border，LB )。T-DNA内的致瘤细胞诱导根瘤细胞，由这类细胞不能再生成植株。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲（disam）后，将细菌抗生素的抗性基因或其他序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
(3)vir的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。
Ti质粒是约200~500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作。
2. Ti质粒的衍生载体根据Ti质粒的特点，现已构建成以下两套质粒衍生的载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体。
(1)双元载体 （binary vector）。这个系统具有两个质粒，一个是用于克隆外源基因片段的克隆质粒，可在大肠杆菌及根瘤土壤杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，也是一种穿梭质粒。在T-DNA序列外，还有细菌选择标记基因，在T-DNA的LB至RB内有一个多克隆位点及植物选择标记基因。如Pbin 19载体，它具有原核生物的卡那霉素抗性基因 (AphI)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因（nos-NptⅡ）作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及a-互补显色标记。双元载体的另一个质粒，如与Pbin 19匹配使用的Pal404质粒是非致病Ti质粒，该质粒没有T-DNA序列，具有Ti质粒的毒性基因，毒性基因表达的产物以反式调控方式控制穿梭质粒上T-DNA的转移。将两个质粒分别导人根瘤土壤杆菌后，经根瘤土壤杆菌介导，克隆质粒中的T-DNA转移到植物基因组中。
(2)共整合载体 (integrated vector)。这个系统也包括两个质粒，一个用作克隆外源基因的质粒 (如Pmon200)，另一个带有毒性基因 (如Ptib6S3-SE)。与双元载体的主要区别是这两个质粒具有一段同源序列，它们在根瘤土壤杆菌中经过重组整合成一个载体，故称共整合载体。
还有另一类用于植物基因工程的载体，不经根瘤土壤杆菌介导而是在其他物理及化学方法的作用下，将外源基因导入植物细胞，并整合到植物基因组中。这种载体与乃衍生质粒不同，与酵母菌穿梭质粒的结构特点类似。它们通常也具有氨卞青霉素抗性基因，用作细菌选择标记;具有潮霉素或除草剂抗性基因用作植物选择标记。这类载体如Pahc25主要用于将外源基因导入单子叶植物细胞
①具复制原点(ori),在宿主细胞中不仅能独立地自我复制,而且能带动携带的外源DNA片段一起复制。
②具有多个克隆位点(multiple cloning site,MCS,或称polylinker region),即具有多种限制性酶的切点,而每一种酶的切点只有一个,用于克隆外源DNA 片段。这些酶切位点不存在于复制原点或抗性选择标记基因内,以保持载体的自主复制特性及表型标记性状。
③至少具有一个选择标记基因,这个基因通常是抗菌素的抗性基因或某种酶的基因,而宿主细胞则没有这种基因,使有或无载体的宿主细胞具有易鉴别的表型。
④易从宿主细胞中吸收。
㈠细菌质粒
现在广泛使用且商品化的质粒,很多都具有重组表型检测标记,在DNA克隆中根据宿主细胞的表型即可推知质粒是否携带外源DNA片段。例如pUC18质粒(图9-3)就具有以下特点:①分子量小(2.69kb),也可以接受较大的外源片段。②拷贝数多,在每个宿主细胞的拷贝数可达500个;③多克隆位点的酶切位点多,克隆方便;④具有α-互补显色表型,可作为检测重组质粒存在于否的选择标记。 α-互补是指来自细菌DNA的lacZ酶(β-半乳糖苷酶)N端的一段氨基酸残基(α-肽),在与α-肽缺失的酶混合后(体外或体内),能恢复lacZ酶的活性的一种基因内互补现象。pUC系列的载体就是利用这一特点而设计的。如图9-3所示, pUC18质粒带有细菌DNA lacZ基因启动子,操纵子,调节基因以及lacZ 基因α-肽(N端的146个氨基酸),在lacZ 基因内插入了一个多克隆位点,这段序列与lacZ在同一个阅读框架内。 pUC18表达的α-肽具有多克隆位点的18个氨基酸残基,仍具有α-互补功能。因此,将pUC18质粒转入带有lacZ 基因α-肽缺失的宿主细菌细胞内后,在含有5-溴-4-录-3-吲哚-β-半乳糖苷(5-bromo-4-chhloro-3-indoly-β-galactopyranoside,)及IPTG的培养基上,质粒产生N端的146个氨基酸,宿主菌产生C端的氨基酸,经α-互补可产生有功能的lacZ酶,水解X-gal产生一种兰色物质,附着于细菌细胞上使菌落呈兰色。当在多克隆位点插入一个外源DNA片段时,破坏了α-肽的阅读框架,或导入转录或翻译终止信号,使α-肽不能正确表达,仅宿主细菌产生的C端氨基酸没lacZ 基因有lacZ 酶活性,结果在上述同样培养条件下,形成的菌落呈白色。所以白色菌落即是带有外源DNA片段的阳性克隆。
㈡λ噬菌体
㈢柯斯质粒
㈣穿梭载体
㈤细菌人工染色体
BAC载体是基于细菌的性因子(F因子)质粒的一些特点构建的。如第6章所述,F因子是细菌细胞内能自我复制的质粒,约100kb,同时能在细菌接合时专一1000kb 的细菌染色体片段。将F因子经基因工程改良构成的BAC载体,可用于克隆100kb以上的DNA片段。带有外源片段的BAC载体在细菌细胞中通常仅单个拷贝,这一特点有利于保持DNA大分子,尤其是重复序列多的大分子,在细胞内稳定复制而不发生重组。BAC载体本身分子量小,如由小F质粒构建的载体pBeloBAC11全长7.4kb(图9-7),仅带有自我复制，控制拷贝数(repE)及质粒(parE,parA,parB)所必须的最少序列。这些基因均来自F因子。BAC载体还具有氯霉素抗性选择基因以及多克隆位点。在pBeloBAC11中,多克隆位点lacZ基因内,因此可采用选择pUC18阳性重组子的方法,即α-互补显色法选择阳性BAC重组子。此外,在多克隆位点两侧,还有T7及SP6启动子位点,用于制备RNA分子,进一步分析克隆的基因表达,作为染色体步行的探针,以及序列测定克隆的片段。
㈥酵母人工染色体
目前应用最多的YAC载体是PYAC4(图9·8)，这个载体具有以下主要结构:①两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因);②酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4);③一个自主复制序列(ARS1); ④两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列 (TEL),以保持重组YAC为线状结构;⑤在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff, HIS3)，以便PYAC4在细菌细胞中稳定扩增;⑥Amp抗性及细菌质粒复制原点;⑦一个EcoR Ⅰ克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。Sup4 基因编码赭色抑制tRNATYR，抑制赭色表型 (成为白色)。如果用不含外源DNA片段的PYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。而带有插入的外源DNA片段的PYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。这种插入失活选择标记的应用，大大简化了阳性克隆工作。
在利用PYAC4载体克隆时，要将PYAC4载体线性化，分离纯化带有染色体末端序列的两个臂，同时分离纯化大分子DNA片段，连接后用于转化酵母菌感受态细胞。
[七]Ti质粒及其衍生载体应用基因工程技术改良植物性状时，需要适合于植物系统，才能将重组DNA运载到植物细胞并使目的基因表达。由Ti质粒衍生的载体，是最早成功地把外源基因导入植物细胞的植物表达载体。
(1) Ti质粒具有5个主要功能区域 (图9-9)。它们分别是T-DNA、质粒转移 (plasmid transfer)、冠瘿碱代谢 (opine catabolism)、复制原点 (oir)和毒性区域 (vir)。
(2)T-DNA中直接参与转移并整合到植物染色体上的序列，仅是T-DNA两端与其他序列交界处的25bp不完全直接重复 (imperfect direct repeat)，右端的这段序列称为右界 （right border，RB），左端的序列称为左界 (left border，LB )。T-DNA内的致瘤细胞诱导根瘤细胞，由这类细胞不能再生成植株。T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲（disam）后，将细菌抗生素的抗性基因或其他序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。
(3)vir的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。
Ti质粒是约200~500kb的环状DNA分子，很难用作DNA克隆载体进行操作。
2. Ti质粒的衍生载体根据Ti质粒的特点，现已构建成以下两套质粒衍生的载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体。
(1)双元载体 （binary vector）。这个系统具有两个质粒，一个是用于克隆外源基因片段的克隆质粒，可在大肠杆菌及根瘤土壤杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，也是一种穿梭质粒。在T-DNA序列外，还有细菌选择标记基因，在T-DNA的LB至RB内有一个多克隆位点及植物选择标记基因。如Pbin 19载体，它具有原核生物的卡那霉素抗性基因 (AphI)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因（nos-NptⅡ）作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及a-互补显色标记。双元载体的另一个质粒，如与Pbin 19匹配使用的Pal404质粒是非致病Ti质粒，该质粒没有T-DNA序列，具有Ti质粒的毒性基因，毒性基因表达的产物以反式调控方式控制穿梭质粒上T-DNA的转移。将两个质粒分别导人根瘤土壤杆菌后，经根瘤土壤杆菌介导，克隆质粒中的T-DNA转移到植物基因组中。
(2)共整合载体 (integrated vector)。这个系统也包括两个质粒，一个用作克隆外源基因的质粒 (如Pmon200)，另一个带有毒性基因 (如Ptib6S3-SE)。与双元载体的主要区别是这两个质粒具有一段同源序列，它们在根瘤土壤杆菌中经过重组整合成一个载体，故称共整合载体。
还有另一类用于植物基因工程的载体，不经根瘤土壤杆菌介导而是在其他物理及化学方法的作用下，将外源基因导入植物细胞，并整合到植物基因组中。这种载体与乃衍生质粒不同，与酵母菌穿梭质粒的结构特点类似。它们通常也具有氨卞青霉素抗性基因，用作细菌选择标记;具有潮霉素或除草剂抗性基因用作植物选择标记。这类载体如Pahc25主要用于将外源基因导入单子叶植物细胞