捉妖记2免费完整版:DNA的粗提取与鉴定

来源:百度文库 编辑:偶看新闻 时间:2024/03/29 05:30:15
重点知识归纳及讲解
 
(一)实验原理
鸟类血液中红细胞有细胞核,细胞核内 DNA与蛋白质结合成染色质。利用DNA在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低,而蛋白质此时的溶解度高的特点,可以使DNA与蛋白质分离,形成沉淀析出,通过过滤,得到粗提取的滤出物DNA。再利用DNA不溶于酒精,但细胞中的其他物质可溶于酒精的特点,进一步提取出含杂质较少的DNA。

利用DNA遇二苯胺(沸水浴)成蓝色的特性,可以鉴定提取的DNA。
(二)实验材料(以鸡血为例)
鸡血细胞液:先配备10%的柠檬酸钠溶液,按180mL新鲜鸡血混合100mL10%柠檬酸钠溶液的比例,立即将血液与柠檬酸钠充分混合,同时用玻璃棒搅拌以免凝血。然后,用离心机以2000转/min的速度离心4min后,用吸管除去离心管上清液,就可获得所需的鸡血细胞悬液。每组大约需要5—10mL鸡血细胞悬液。如果无离心机,可将与柠檬酸钠充分混合的血液置于冰箱内,静置一天,使血细胞自行沉淀后,也可获得所需的鸡血细胞悬液。
(三)试剂与仪器
1、2mol/L的NaCl溶液
称取117g的NaCl,加蒸馏水至1000mL,使之完全溶解,即可获得2mol/L 的NaCl,须按此配方配备大量的2mol/L 的NaCl。
2、二苯胺试剂
A液——1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中,再加1.5mL浓硫酸,用棕色瓶保存。B液——体积分数为0.2%的乙醛溶液。实验前,将0.1mL的B液加入到10mL的A液中,现配现用。
3、0.015mol/L的NaCl溶液
称取0.88g氯化钠加蒸馏水至1000mL,使之完全溶解。
4、塑料杯和试管
DNA易吸附在玻璃器皿上,用塑料杯和试管可减少提取过程中DNA的损失。
(四)实验方法与步骤
1、提取细胞核物质
取5—10mL鸡血细胞悬液入烧杯中,加蒸馏水20mL,同时,用玻璃棒沿一个方向快速充分搅拌,使血细胞过度吸水破裂,细胞核内物质释放出来,然后用纱布过滤取其滤液。

2、溶解核内的DNA
在滤液中加入2mol/L的NaCl40mL,并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min,核中DNA游离并充分溶解,染色质中的DNA和蛋白质分离。

3、析出DNA黏稠物
沿烧杯内壁缓慢加入蒸馏水,同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌。由于溶液浓度的下降,使得 DNA溶解度下降,蛋白质溶解度上升,DNA析出成白色丝状黏稠物,当黏稠物不再增加时,停止加入蒸馏水。
4、滤取DNA黏稠物
用多层纱布过滤,取纱布上 DNA的黏稠物。
5、DNA黏稠物再溶解
取含DNA的黏稠物放入桡杯内,加入2mol/L的NaCl溶液40mL,用玻璃棒沿一个方向不停搅拌3min,使黏稠物尽可能多地溶解。
6、过滤含DNA的氯化钠溶液
用两层纱布过滤含 DNA的氯化钠溶液,取其滤液。

7、提取含杂质较少的DNA
在滤液中加入冷却的无水乙醇,并用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌,由于 DNA不溶于酒精,会出现乳白色丝状物,用玻璃棒将丝状物卷起,并用滤纸吸去表面的水分。
8、DNA的鉴定
两支试管中各加入0.015mol/L的NaCl溶液5mL,将丝状物放入其中一支试管中,搅拌使其充分溶解后,向两支试管中分别加入4mL 二苯胺试剂,混匀后沸水溶中加热5min,待试管冷却后,比较两试管的颜色变化,将发现加入DNA的试管中的溶液呈蓝色,从而鉴定DNA的存在。

(五)注意事项
(1)制备鸡血细胞液时,要在取新鲜鸡血的同时加入抗凝剂,使血液分层,取下层血细胞沉淀。
(2)获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水,以便使细胞膜和核膜破裂,核内物质释放出来。
(3)实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3次要取其滤液,使用的纱布为1—2层,第2次是要取其滤出的黏稠物,使用的纱布为多层。
(4)实验中有6次搅拌,除最后一次搅拌外,前5次搅拌要朝向一个方向,并且在析出DNA,DNA再溶解和提取中,各步搅拌都要轻缓,玻璃棒不要直插烧杯底部,防止DNA分子断裂。
(5)实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步,加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂,加水后必须充分搅拌,不应少于5min,使血细胞充分破裂;第二次加蒸馏水是在第3步,加水是为了稀释氯化钠溶液。
(6)实验中有三次加氯化钠溶液。在步骤2中,当加入氯化钠后,必须充分晃动烧杯,使二者混合均匀,加速染色质中DNA与蛋白质分离,使DNA充分游离,并溶解在氯化钠溶液中。在步骤5中,加氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解,不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中,加的NaCl溶液的浓度比前2次低的多,但还是为溶解DNA。
(7)在步骤7中,必须使用冷酒精(至少在5℃以下存放24h),并且将1份含DNA的NaCl溶液加入到2份的冷酒精中。如果悬浮在溶液中的DNA丝状物较少,可将混合液放入冰箱中再冷冻几分钟。
(8)本实验成功的关键,是保证提取到足量且较纯净的DNA。因为DNA在细胞中含量少,所以在下列步骤中应特别注意:在步骤1中使用的鸡血的量要在180mL左右。提取细胞核物质时要充分搅拌5min以上。在步骤2中要充分晃动烧杯,在步骤3中加蒸馏水要控制好量,同时应用玻璃棒缓缓搅动使DNA聚集其上。在第4步中要使用多层纱布过滤,在第5步中要充分搅伴,在第7步中使用冷酒精。因为DNA易吸附在玻璃容器上,所以实验中最好使用塑料烧杯和试管,以减少DNA的损失。
(9)盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯和试管最好也是塑料制的,因为玻璃制品表面带电荷,DNA中的磷酸基带相反的电荷,会被吸附于玻璃表面,减少DNA含量。
(六)实验现象与讨论
最后一次搅拌时,玻璃棒上会有乳白色丝状物出现,这就是DNA。用二苯胺试剂鉴定时会发现试管中溶液呈蓝色。
本实验较为复杂,对材料的量以及实验过程有较高要求。
讨论1、为什么在第4步“滤取DNA粘稠物”中纱布上的DNA粘稠物有的为血红色?
其原因可能是在第一步搅拌时,搅拌不充分。
讨论2、有的同学在最后一步“DNA的鉴定”中,发现两支试管的颜色变化不很明显,其原因是什么?  试管内的颜色变化要在煮沸5min后,冷却观察就会很明显。
 
课外拓展
 
一、以菜花为实验材料进行DNA的粗提取
课前准备:将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放人冰箱冷冻室24h。
提取DNA的具体步骤
1、取材:称取30g菜花,去梗取花,切碎。
2、研磨:将碎菜花放入研钵中,倒入10mL研磨液,充分研磨10min。
研磨液的配制方法如下。将10.1g Tris(三羟甲基氨基甲烷)加入到50mL蒸馏水中,使其溶解,然后,用2mol/L的HCl溶液调节pH至8.0,再加入8.76g NaCl、37.2g EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、20g SDS。待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1000mL。
一般地,实验室提取高纯度的DNA都采用一种阳离子去污剂——十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液,使细胞膜破碎,同时将DNA与植物中多糖等杂质分开,再用氯仿一异丙醇混合液(体积比为24:1)抽提去除杂质蛋白,得到高纯度的DNA。
3、过滤:在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1000r/min的转速,离心2~5min,取上清液放入烧杯中)。在4℃冰箱中放置几分钟后,再取上清液。
4、沉淀将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的预冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀3~5min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,将絮状物缠绕在玻璃棒上。
二、二苯胺鉴定DNA的化学原理
DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω羟基一γ基戊醛,它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。