阿克巴巴强:用于基因组文库中的真核DNA的部分酶切：预反应

来源：百度文库编辑：偶看新闻时间：2024/04/24 01:57:10

摘要：本文主要介绍了用于基因组文库的真核DNA的部分酶切之预反应的实验方法.

材料：
    缓冲液和溶液：蔗糖凝胶上样缓冲液；Tris-Cl（10mmol/L,ph8.0）；
    酶和缓冲液：限制性内切核酸酶；
   凝胶：琼脂糖凝胶；琼脂糖凝胶（0.6）,用0.5*TBE,含有0.5ug/ml的溴化乙锭.琼脂糖凝胶,用于脉冲场凝胶电泳
    核酸和寡核苷酸：基因组DNA,高分子质量；λ噬菌体DNA和质粒寡聚体
    专用设备：毛细管,封口透析袋；煮过预置于70℃的水浴；宽口移液尖头
方法：
1、利用将被用于制备克隆片段的同一份基因组DNA建立预实验.
A、将30ug高分子质量真核DNA用10mmol/L Tris-Cl(ph8.0)稀释至900ul,加入100ul适当的10*限制酶缓冲液.
B、用一个封口的玻璃毛细管将溶液轻轻混匀,确保高分子质量DNA已完全均匀地分布于限制酶缓冲液中.
C、混匀后,将稀释DNA于室温放置1h,使残余的DNA聚集块能彻底地解散.
2、用1至10标记微量离心管.用一宽口的玻璃毛细管或一次性塑料移液器尖头将60ulDNA溶液转移至一微量离心管中（第1管）.转移30ulDNA溶液至其他标记的9个微量离心管中.冰浴放置.
3、加2单位适当的限制酶至第1管中.
4、用一新鲜的移液尖头将第1管中30ul反应液转移至系列离心管的第2管内.如前所述混匀,继续转移至下一个离心管中.在第10管中不加任何东西（无酶对照）,同时从第9管中取出30ul舍弃.
5、37℃温育1h.
6、70℃加热15min,使酶失活.
7、将反应冷却至室温,加入适当量的蔗糖凝胶上样缓冲液.
8、用宽口塑料移液尖头或一次性玻璃毛细管将溶液转移至0.6%琼脂糖凝胶的点样孔内,更好的是转移至脉冲场凝胶电泳的上样槽中,随后进行电泳.
9、将消耗的真核DNA大小与含λ噬菌体和质粒寡聚体的DNA标准进行比较.鉴别能获得大量理想大小基因组DNA的部分酶切条件.

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