偶看新闻印度电影武力1下载:高中生物选修本中的问题解答⑷
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/04/25 19:56:17
高中生物选修本中的问题解答⑷----PCR技术专题
广州执信中学
1.什么是PCR的预变性？为什么要进行预变性？
PCR在开始时会进行一次预变性，时间比一般的变性长，加热时间大约是5分钟，一般的变性时间则只需要半分钟（30秒），预变性的主要目的是增加大分子模板DNA彻底变性的机会。
2．如何测定扩增后的DNA含量变化？
可以选择的方法有二苯胺法、紫外灯照射法、电泳等。
3.出现假阳性的原因及解决方法？
PCR的灵敏性极高，及其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，而出现假阳性反应。
这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染。解决方法：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。
另外，引物设计不合适，靶序列太短或引物太短，也容易出现假阳性。如选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。若是引物问题则需重新设计引物。
4.PCR出现假阴性的原因及解决方法？
PCR出现假阴性的原因：TaqDNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提供的模板质量或数量不过关以及PCR系统建立欠妥当；循环次数不够；等等，最终令实验没有结果而出现假阴性。
解决办法：首先应在原来的扩增产物中加入TaqDNA聚合酶，并增加循环5-10次；在提取DNA模板时，应避免在提取物中存在抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等；PCR扩增的成功与否，很大程度取决于引物与靶DNA的互补情况，所以务必要保证引物的3’与靶DNA互补。
5．在PCR反应中如何设置对照实验？
对照试验一般都会加阴性对照，阳性对照。如果你只想检控PCR操作及扩增，就加水作为阴性对照，阳性质粒或者DNA作为阳性对照。
如果是为了检测某种DNA或者RNA的话，那你的空白对照，就是在那个空白对照的体系里不加入底物就好了。
如果你想监控整个核酸提取过程，及PCR过程的话，那就从核酸提取开始，就将水作为阴性样本做对照，含模板DNA的菌或者病毒或者组织作为阳性对照。
阴性对照（核酸模板用灭菌去离子水代替），证明没有模板污染，如果阴性对照管出现异常结果，可能是试剂或者去离子水有模板污染。