2010年6月15日卢先生《原核表达及相关领域应用》讲座文字实录+课件+问答  

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 .pcb{margin-right:0}生物秀邀请中医药研究院实习研究员卢先生于6月15日在生物秀论坛进行了以《原核表达及相关领域应用》为主题的在线知识讲座，受到秀友的广泛欢迎，讲座取得圆满成功！
下面是超级QQ群在线讲座文字实录并附课件下载及问答环节实录：
主讲卢先生(1137954285)18:57:04
应生物秀的盛情邀请和大家交流下，本人水平有限可能会有许多浅陋不到之处，大家一定要指出批评，
共同学习提高

主讲卢先生(1137954285)18:57:17
十分钟之后开始，希望大家不要插话

主讲卢先生(1137954285)18:58:08
等我讲完给大家20分钟提问，然后我按照问题的顺序一一解答，我不会的就说不会，请会的朋友解答

主讲卢先生(1137954285)19:07:22
讲座开始。大家好！受版主之邀，再次就我所做的领域给大家做一个简单的讲解，算是对上一期的一个
补充，希望大家能有所收获。

主讲卢先生(1137954285)19:08:10

今天我们承接上一讲PCR技术，来谈一谈原核表达技术及其在相关领域的应用。
首先，给大家简单介绍一下，近年来生物学领域出频率非常高的一个词：基因工程。

主讲卢先生(1137954285)19:08:52
基因工程：是用分离纯化或人工合成的DNA在体外与载体DNA结合，成为重组DNA，用以转化宿主（细菌
或其它细胞），筛选出能表达重组DNA的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆，产生出人类所需
要的基因产物或改造、创造新的生物类型。这整个一系列的技术称为基因工程。

主讲卢先生(1137954285)19:11:14

基因工程的应用包括
主讲卢先生(1137954285)19:11:24
1.抗虫转基因植物
2010-6-18 10:42:50 上传下载附件 (79.68 KB)
主讲卢先生(1137954285)19:11:58
抗病转基因植物
2010-6-18 10:42:53 上传下载附件 (92.27 KB)

主讲卢先生(1137954285)19:12:54
经过基因工程改造的新物种
主讲卢先生(1137954285)19:13:19
这东西能不鞥活我还不知道
2010-6-18 10:42:55 上传下载附件 (73.65 KB)

主讲卢先生(1137954285)19:13:38
也有许多其他的转基因作物
2010-6-18 10:42:58 上传下载附件 (134.81 KB)
2010-6-18 10:43:01 上传下载附件 (114.71 KB)

主讲卢先生(1137954285)19:14:46
好，下面介绍下基因工程的应用领域

主讲卢先生(1137954285)19:15:07
主要包括以下6个方面
1.   蛋白质功能研究
       2.   生物制药和疫苗生产
       3.   疾病的基因治疗
       4.   食品、化工用酶制剂
       5.   抗虫、抗逆植物改良     
       6.   细胞代谢产物的富集

主讲卢先生(1137954285)19:15:48

可以说，基因工程技术的发展给人类生活带来了翻天覆地的变化，造物再不是上帝的特权，只要有可能
，我们人人都可以是造物主。

主讲卢先生(1137954285)19:16:56在介绍基因工程的详细内容之前，给大家简单的介绍一下中心法则和一些概念。
DNA----RNA------protein
DNA，即脱氧核糖核酸，是自然界最主要的遗传物质，是生物体遗传信息的最主要，最重要的承载者。
RNA，即核糖核酸，是遗传信息的传递者，同时也是某些物种如一些病毒的遗传物质。
从DNA---RNA称为转录，逆过程为逆转录。
蛋白质，是所有遗传性状的最终体现者，是所有生命活动的根本物质基础。
从RNA----蛋白质即翻译或称表达过程。目前还没有发现其逆过程。
所以，要改变物种的形状，根本上就是要改变与产生这种形状的蛋白的结构与功能。而蛋白的结构与功
能又全部记载在遗传物质DNA上，所以改变其遗传物质的结构即能改变其生物性状，基因工程正是基于
这种理念建立起来的。

主讲卢先生(1137954285)19:18:34

基因工程的一般流程分为，从人体或其他生物钟个体中提取目的基因-------------与载体拼接---转化
至细菌中（宿主细胞）生产重组蛋白。
这简单的几步却是依赖于许多重要的基因操作工具的发现才得以实现的。这其中最最重要的就是工具酶
的应用。

主讲卢先生(1137954285)19:20:49

一. 核酸分子剪刀----限制性核酸内切酶
   识别回文序列，产生粘性或平性末端，具有相同粘性或平性末端的不同DNA片段可连接起来形成重组
DNA分子，故DNA限制性内切酶是分子生物学实验中重要的工具酶。识别双链DNA内部特异位点并裂解磷
酸二酯键

主讲卢先生(1137954285)19:22:40

分类：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型
命名：EcoRⅠ(E：属名；co：种名；R：株；Ⅰ：发现次序)
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，其
切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，
无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。

主讲卢先生(1137954285)19:25:08第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割
双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，
具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。

主讲卢先生(1137954285)19:26:15

还有最重要的第二类(II型)限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双
链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技
术中最常用的工具酶之一。
这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个
、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：

主讲卢先生(1137954285)19:28:39

粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以
称为粘性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G           AATTC……3’
3’……CTTAA           G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘
合”。
平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：   
        5’…… GAT|ATC …… 3’
        3’…… CTA|TAG …… 5’ 　
切割后形成
        5’…… GAT   ATC …… 3’
        3’…… CTA   TAG …… 5’
这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。

主讲卢先生(1137954285)19:29:40大家详细了解下这种类型的酶

主讲卢先生(1137954285)19:30:01

这是我们分子克隆中最常用的酶

主讲卢先生(1137954285)19:31:30

了解下粘性末端的概念

主讲卢先生(1137954285)19:31:44

相对于平末端

主讲卢先生(1137954285)19:31:56

它的优势是什么

主讲卢先生(1137954285)19:32:06

下面介绍一下一些特殊的限制性内切酶
同裂酶和同尾酶：
同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶
（同切酶或异源同工酶）。
同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例
如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是
5’……G|CG G……3’
3’……G GC|G……5’
如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。
同尾酶：
有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶
同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。
如Xba1和Nhe1:
  5'…T|CTAGA…3’     5'…G|CTAGC…3’
  3'…AGATC|T…5’     3'…CGATC|G…5’
  5'…T   CTAGA…3’  5'…G   CTAGC…3’
  3'…AGATC   T…5’  3'…CGATC   G…5’
              5'…TCTAGC…3’
              3'…AGATCG…5’
    这些粘性末端连接后，Xba1和Nhe1酶将不能再切割，但可以利用Bfa1(酶切识别位点为GATC)来进行
再切割。

主讲卢先生(1137954285)19:33:56

内切酶就给大家介绍到这里，相信大家已经有了初步了解

主讲卢先生(1137954285)19:34:14

下面介绍另一种酶

主讲卢先生(1137954285)19:34:29二、DNA连接酶
催化双链DNA一端的3’OH与另一双链DNA5’的磷酸根形成3’，5’-磷酸二酯键，使具有相同粘性末端
或平末端的DNA末端连接起来



主讲卢先生(1137954285)19:35:08

我们最常用的就是T4连接酶
2010-6-18 10:43:02 上传下载附件 (15.3 KB)

主讲卢先生(1137954285)19:37:33以上就是它的链接原理示意图

主讲卢先生(1137954285)19:39:03

下面介绍分子生物学发展史中最重要的一种酶

主讲卢先生(1137954285)19:39:17

没有它的发现，基因工程只是一句空话

主讲卢先生(1137954285)19:39:37

DNA聚合酶(DNA polymerase)
主讲卢先生(1137954285)19:40:30
准确的说应该是耐热Taq DNA聚合酶

主讲卢先生(1137954285)19:40:52

来自于嗜热的栖热水生菌Thermus aquaticus
中纯化而来的。
②5’®3’聚合酶活性
③5’®3’外切酶活性
④最佳作用温度为75-80°C
耐热的DNA聚合酶的发现是基因工程发展史上的里程碑。直接导致了PCR技术的建立

主讲卢先生(1137954285)19:42:48
那么我们最常用的重组Taq酶呢

主讲卢先生(1137954285)19:43:34是来源于大肠杆菌DNA聚合酶大片段（Klenow片段

主讲卢先生(1137954285)19:44:16
其只具有  5’®3’聚合酶活性
               

主讲卢先生(1137954285)19:45:22
好，下面介绍基因工程中一个重要的工具

主讲卢先生(1137954285)19:45:24
载体
主讲卢先生(1137954285)19:45:39
基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些
载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限
制酶切点等。

主讲卢先生(1137954285)19:46:59这里我们主要介绍原核表达中常用质粒载体

主讲卢先生(1137954285)19:47:04质粒载体
是存在于天然细菌体内的一种独立于细菌染色体之外的双链环状DNA，具有独立复制的能力，通常带有
细菌的抗药基因。 最早使用的质粒DNA是人工构建的pBR322，该质粒分子大小为4.3kb，带有抗四环素
和抗氨苄青霉素基因，含EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的限制酶切点。

2010-6-18 10:43:02 上传下载附件 (32.44 KB)

主讲卢先生(1137954285)19:47:51

这个是最早一代载体

主讲卢先生(1137954285)19:47:57治理载体

主讲卢先生(1137954285)19:48:01
质粒

主讲卢先生(1137954285)19:48:52

质粒载体具有以下特征

主讲卢先生(1137954285)19:48:53
1.自主稳定复制 松弛型质粒
2.具有多种限制性内切酶酶切位点
3.遗传标记
4.插入容量大
5.分子量小，拷贝多
6.安全

主讲卢先生(1137954285)19:50:04目前我们常用的商用载体主要有
pJLA50X系列 pcDNAII; etc
pET系列      (T7 promoter, Novagen公司)
pQE系列     (T5 promoter, Qiagen公司)
pMAL系列  (周质表达, BioLabs公司)
pGEX系列   (GST融合表达, Pharmacia公司)
pBAD系列     (Arabinose诱导型)


主讲卢先生(1137954285)19:50:29这里主要给大家看看pET系列


他可以说是目前最强大的原核表达载体系列

发明这种载体的冷泉港科学家因此获得诺贝尔

主讲卢先生(1137954285)19:51:56
好，
主讲卢先生(1137954285)19:52:05
给大家10分钟消化下
主讲卢先生(1137954285)19:52:10
下面进入第二章
主讲卢先生(1137954285)19:58:02
下面涉及技术领域，可能实用性很强

主讲卢先生(1137954285)19:59:07
好，第二部分是核心
二、原核表达载体的构建包括以下步骤
1. 目的基因的获取
2. 克隆载体的选择与构建
3. 外源基因与载体的连接
4. 重组DNA导入受体菌
5. 重组体的筛选
6. 克隆基因的表达

主讲卢先生(1137954285)20:01:07目的基因的获取
目的基因是人们所需要转移或改造的基因。如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、
抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。获取目的基因的方法有
1.从染色体DNA中分离
2.人工合成
3.从mRNA合成cDNA   
4.基因文库

主讲卢先生(1137954285)20:01:44目的基因的获取是表达的第一步

主讲卢先生(1137954285)20:01:51
非常重要

主讲卢先生(1137954285)20:02:43它涉及目的基因的选择
比如我们要选用一些有经济价值的功能性基因

主讲卢先生(1137954285)20:03:16
其二还要评估这个基因在原核系统中表达的可行性

主讲卢先生(1137954285)20:03:41
第三，基因的获得是否容易
主讲卢先生(1137954285)20:04:23
目前世界上已经建立了庞大的基因库

主讲卢先生(1137954285)20:04:46
这是我们获取基因序列的有力工具

主讲卢先生(1137954285)20:05:15

一般来说已知序列的基因获取相对比较容易

主讲卢先生(1137954285)20:05:37

主要是利用逆转录技术结合PCR技术

主讲卢先生(1137954285)20:05:49还有人工合成

一般来讲

我们用于克隆表达的基因绝大多数是PCR产物

通过PCR将其两端添加酶切位点


主讲卢先生(1137954285)20:09:02下面呢就是选择表达载体

主讲卢先生(1137954285)20:09:16

这是构建原核表达系统中极其重要的一环

主讲卢先生(1137954285)20:09:24

主要包含以下原则

主讲卢先生(1137954285)20:09:58

第一，是否选用可溶性表达载体

主讲卢先生(1137954285)20:10:57

这类表达载体一般会在含有多克隆位点的读码框内末端连上一段可溶性标签

主讲卢先生(1137954285)20:11:12

如 His GST 等等

主讲卢先生(1137954285)20:11:36第二就是要看这个载体的多克隆位点

主讲卢先生(1137954285)20:11:48

它包含哪些酶切微点
主讲卢先生(1137954285)20:12:35

是否高效的常用位点

主讲卢先生(1137954285)20:13:48

第三 这个表达载体在宿主中的稳定性，拷贝数

主讲卢先生(1137954285)20:14:14

以及这个载体的启动子强度，等等

主讲卢先生(1137954285)20:15:03

第四，选用这个载体表达蛋白是否有利于下游蛋白的纯化

主讲卢先生(1137954285)20:16:20

目前就给大家总结这些，还有很多要注意的

主讲卢先生(1137954285)20:16:30

那么选定表达载体后

主讲卢先生(1137954285)20:16:42

再确定采用什么酶切位点

主讲卢先生(1137954285)20:17:27具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定
有多个限制性内酶切位点，至少有两种酶能在同一体系中反应。
拷贝数高，表达量高，表达稳定。
具有强启动子和相应的表达标签和蛋白酶位点，便于表达产物的鉴定纯化。

主讲卢先生(1137954285)20:17:36这是一个常用选择标准

主讲卢先生(1137954285)20:19:59好，完成以上，我们就往下做了

主讲卢先生(1137954285)20:20:15下面对PCR产物进行双酶切
2010-6-18 10:43:03 上传下载附件 (30.4 KB)

主讲卢先生(1137954285)20:21:04这是一个示意图

主讲卢先生(1137954285)20:22:35

双酶切后目的片段和载体都形成了相对应的粘性末端

主讲卢先生(1137954285)20:23:10

回收酶切产物后，我们就要把载体和片段连接起来
2010-6-18 10:42:48 上传下载附件 (41.77 KB)

主讲卢先生(1137954285)20:23:48这是一个链接示意图

主讲卢先生(1137954285)20:24:56

连接后理论上片段插入载体形成重组体，我们就要进行转化筛选出正确的重组体了

主讲卢先生(1137954285)20:25:24重组体的转化有以下方法
1. 重组体导入大肠杆菌
（1）氯化钙法
（2）电击法
（3）体外包装法
2. 重组体导入哺乳动物细胞
（1）磷酸钙共沉淀法
（2）脂质体介导法
（3）病毒感染法
（4）显微注射法

主讲卢先生(1137954285)20:25:46原核表达系统呢

主讲卢先生(1137954285)20:26:04

钙转和电转比较常用

主讲卢先生(1137954285)20:26:26

其中电转能获得更好的转化效率

主讲卢先生(1137954285)20:26:53
一种低级真核表达系统，酵母

主讲卢先生(1137954285)20:27:00
常用电转

主讲卢先生(1137954285)20:27:19普通大肠杆菌钙转足矣

主讲卢先生(1137954285)20:27:32如果构建文库可能需要电转

主讲卢先生(1137954285)20:27:45

比如噬菌体文库
主讲卢先生(1137954285)20:28:27
转化进宿主细胞后我们就要进行重组体筛选了
主讲卢先生(1137954285)20:29:16
有以下几种方法
1.目的基因检测（PCR)
2.DNA限制酶切图谱分析
3.根据重组载体的表型进行筛选
4.利用核酸杂交和放射自显影进行鉴定

主讲卢先生(1137954285)20:29:50
实际原核载体构建中
主讲卢先生(1137954285)20:30:19
主要采用菌落PCR，双酶切和表达分析三步确定重组是否成功
主讲卢先生(1137954285)20:30:35
三步缺一不可
主讲卢先生(1137954285)20:31:00
单独来看，每一种鉴定方法都可能会出现假阳性
主讲卢先生(1137954285)20:31:24
鉴定成功后
主讲卢先生(1137954285)20:31:35
下面就可以放心的生产蛋白了
主讲卢先生(1137954285)20:32:00
好，以上就是整个原核表达载体构建的过程

主讲卢先生(1137954285)20:32:27
下面我们讲一些技术要领和注意事项
主讲卢先生(1137954285)20:32:37
5分钟后开始

主讲卢先生(1137954285)20:35:15
常见注意事项
1.载体的选择               
2.酶切位点的选择与克隆引物的设计
3.酶切反应的设计
4.酶切实验
5.连接比例的设置
6.连接温度与时间
7.感受态细胞的制备
8.转化
9.重组子的鉴定

主讲卢先生(1137954285)20:35:34

以上9条是我罗列的需要注意的

主讲卢先生(1137954285)20:35:51大家如果做好了，做克隆如切豆腐

主讲卢先生(1137954285)20:37:13

前面已经说了载体的选择

主讲卢先生(1137954285)20:37:32

我们从酶切位点开始说起

主讲卢先生(1137954285)20:37:53酶切位点的选择       必须是选定载体的MCS上的两种酶切位点       尽量选用能产生粘性末端的限制性内切酶位点       目的基因中不能含有选用的酶切位点       两种酶尽可能在同一体系中反应，并且具有相近的切割效率       为了保证切割效率，在设计的克隆引物的酶切位点前面必须加上合适的保护碱基
主讲卢先生(1137954285)20:39:01最后再加一点，为了保证你的表达产物不带入外源载体序列，请尽量选用编码起始区域的位点

主讲卢先生(1137954285)20:39:51

比如pET系列中尽量选用Nco 1 Nde1  

主讲卢先生(1137954285)20:40:34然后记得下游引物中常要引入终止密码子

主讲卢先生(1137954285)20:40:44

视情况而定

主讲卢先生(1137954285)20:41:04酶切反应
大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的10%。
反应混合物中基因组DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组DNA会形成粘性DNA溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的基因组DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。同时RNA应该尽量消化去除。
当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。
反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。
酶切底物DNA应具备一定的纯度，如果溶液中含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于10mM的EDTA，SDS以及过量的盐离子浓度，都会不同程度影
响限制酶的活性。

主讲卢先生(1137954285)20:48:01
好，继续
主讲卢先生(1137954285)20:48:20
连接反应
连接比例的设置
连接比例目的基因与载体量3：1～8 ： 1，具体比例按
照跑胶条带的亮度与宽度设计。
经验公式：
n（L1×K1×M2/L2×K2×M1）=1 (1L1,K1,M1为目的基因的亮度，宽度，分子量，对应的为
载体的。如果超出范围按极值计算。
连接在16℃，12～16h.

主讲卢先生(1137954285)20:48:42
这只是一个粗略的估算方法

主讲卢先生(1137954285)20:48:56大家具体分析决定

主讲卢先生(1137954285)20:50:22
转化
热击温度，时间
42℃, 90s 这里温度与时间一定要控制精确
转化体系
连接产物不能超过体系总体积的1/5

主讲卢先生(1137954285)20:50:45
这个90s不同的感受态不一样，大家具体分析

主讲卢先生(1137954285)20:50:58一般来说30s-90s均可行

主讲卢先生(1137954285)20:51:31
还有连接体系

主讲卢先生(1137954285)20:51:58一般来说连接体系越小越好

主讲卢先生(1137954285)20:52:14
一般5-20微升

主讲卢先生(1137954285)20:52:54

这是指感受态以100或200微分装的时候

主讲卢先生(1137954285)20:53:05对照设置
初次做克隆，建议设置双对照，阴性对照：以切开的质粒作为连接产物进行转化。阳性对照：以载体质粒作为对照

主讲卢先生(1137954285)20:53:29阴性对照确定你的酶切效率

主讲卢先生(1137954285)20:53:43阳性对照确定你的转化效率

主讲卢先生(1137954285)20:54:04

下面是阳性重组子的鉴定了

主讲卢先生(1137954285)20:54:52阳性克隆的鉴定
菌落PCR鉴定
对于大肠杆菌而言，一般10-16h基本能长出克隆，超过16h长出的小菌落或者卫星菌落一般不是重组子。
连接产物生长的菌落一般不是很多，如果平板中菌落数非常多，可能是载体酶切不完全，自连严重。也有可能是污染。
挑取克隆的时候以在规定时间范围内长出的单一菌落为主，最好不要在菌落丛生很密的区域挑取克隆。
挑取的克隆至小管培养4-5h,即可以用菌液做模板进行菌落PCR鉴定。
双酶切鉴定
菌落PCR鉴定为阳性的克隆要进一步小提质粒做双酶切鉴定。对于插入片段小的酶切鉴定，酶切时间不要太长，2-3h足够。防止切下的小片段弥散。

主讲卢先生(1137954285)20:55:19课件中有我做实验的图片

主讲卢先生(1137954285)20:55:25大家可以看看

主讲卢先生(1137954285)20:55:59

依次是菌落PCR,双酶切

主讲卢先生(1137954285)20:56:04表达分析

主讲卢先生(1137954285)20:56:22
表达鉴定
经过菌落PCR鉴定和双酶切鉴定的重组子，一定要进行最后的表达鉴定。只有看到与预期大小相近的蛋白表达，原核载体的构建才算成功。
将菌落PCR，双酶切鉴定为阳性的克隆子，提质粒转化至表达工程菌中，如BL21，然后诱导表达，PET系列载体使用的是T7启动子，使用IPTG诱导。SDS-PAGE鉴定。
以未诱导作对照，以分子量marker作为大小鉴定。确定目的蛋白的表达。

主讲卢先生(1137954285)20:57:33
好了，以上部分呢，就是整个原核表达载体构建过程和注意的了
主讲卢先生(1137954285)20:57:49
给大家10分钟看看吧
主讲卢先生(1137954285)20:58:02
10分钟后浅谈下蛋白质表达策略
灯泡(1024780226)20:58:42
为什么到了表达要浅谈，貌似对于表达才是问题较多的地方啊
主讲卢先生(1137954285)20:59:34
我是准备系列之三给大家讲讲表达与纯化的

主讲卢先生(1137954285)21:14:03
可溶性表达
A:  优化表达条件实现可溶性表达
       降低诱导温度，振摇速度
       降低诱导物浓度
      培养基中添加促溶物质
                        B:  融合表达
               采用Nus\MBD、GST、thioredoxin融合表达
                       C: 选择适宜宿主菌
                            采用Origami，Rosetta 等宿主菌
                       D: 周质腔表达
                           CBD融合  (pET36/37)、Dsb融合  (pET39/40)
采用带pelB/ompT引导肽的载体(pET12/20/22)
采用带MBD融合 (pMAL载体, Biolabs) 、SUMO融合

主讲卢先生(1137954285)21:14:19这是最常见的一种表达选择

主讲卢先生(1137954285)21:14:40

因为一般来说可溶性蛋白才有生物学活性

主讲卢先生(1137954285)21:19:03
第二种选择

主讲卢先生(1137954285)21:19:20
包涵体表达
并不是所有蛋白都能在大肠杆菌中实现可溶性表达，绝大多数真核蛋白在大肠杆菌中是以包涵体形式存在的。
包涵体表达有以下优点
表达量高
表达产物对宿主细胞没有毒性
表达条件不苛刻

主讲卢先生(1137954285)21:21:58
这是原核表达体系中最普遍的表达成荣略

主讲卢先生(1137954285)21:22:07大家根据需要进行选择

主讲卢先生(1137954285)21:23:34
那么对于前者，可溶性表达呢

主讲卢先生(1137954285)21:23:39
可溶性表达分析
真核蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达速度极快，并且缺少相应的折叠修饰机制，容易无规则折叠堆积形成不溶性包涵体。为了获得可溶性活性蛋白，主要是通过改变诱导培养条件，如培养基成分，温度，转速，IPTG浓度等来减慢细菌的代谢速度，调节蛋白表达，促使形成可溶性蛋白。

主讲卢先生(1137954285)21:24:43
低温，低诱导浓度，低转速通常用来增加可溶性表达

主讲卢先生(1137954285)21:26:12
至于后面纯化，蛋白质变复性我们留到下一期

主讲卢先生(1137954285)21:26:20
和大家一起讨论
主讲卢先生(1137954285)21:26:32
以上就是今天所有内容
主讲卢先生(1137954285)21:26:37
谢谢大家收看了

卢先生《原核表达及相关领域应用》课件下载：
http://bbs.bbioo.com/thread-63511-1-1.html

6月15日卢先生讲座问答环节文字整理：
http://bbs.bbioo.com/thread-63927-1-1.html