偶看新闻俊凌厨具高速压面机:专题5 DNA与蛋白质技术 专题复习表解
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/04/29 21:59:35
吉林省梨树县第一高级中学 姜万录
高考要求
实 验
要 求
（1）DNA粗提取与鉴定
（2）PCR技术的基本操作和应用
（3）蛋白质的提取和分离
掌握程度参考本考试大纲中的：
一、考核目标与要求
2．实验与探究能力
知识整合
1.DNA与蛋白质提取分离与鉴定比较
比较项目
DNA粗提取与鉴定
血红蛋白的提取和分离
实验方法
盐析法、酒精沉淀法和显色法
凝胶色谱法和电泳法
实验原理
1.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（如图）：
在2mol/LNaCl溶液中，DNA溶解，部分蛋白质盐析生成沉淀，过滤可除去部分蛋白质；在0.14mol/LNaCl溶液中时，DNA析出，过滤可除去部分蛋白质。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。
3.利用DNA遇二苯胺（沸水浴）成蓝色的特性，可以鉴定提取的DNA
1. 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，通过的路程短，移动速度快；相对分子质量小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程长，移动速度慢。因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量小的分子后流出。因此得以分离。
2. 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的的。
实验步骤
1.实验材料的选取
一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难。实验中一般选用鸡血或菜花作为实验材料，不选择哺乳动物的血细胞，因为其红细胞无核，很难提取到DNA。
2.破碎细胞，获取含DNA的滤液
以动物细胞为实验材料时，破碎细胞较容易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。以植物细胞为材料时，充分研磨破坏了细胞壁，洗涤剂中的表面活性剂成分能够与膜蛋白结合从而破坏细胞膜，这些为核DNA的释放提供了通道。同时要加入食盐使DNA溶解，便于提取。
3.去除滤液中的杂质
根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开。
（1）利用DNA在不同NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
（2）直接在滤液中加入嫩肉粉，使嫩肉粉中的木瓜蛋白酶分解蛋白质。
（3）将滤液放入60℃～75℃的恒温水浴箱中保温10～15min，注意严格控制温度。
4.DNA的析出与鉴定
在滤液中加入冷却的无水乙醇，并用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，由于 DNA不溶于酒精，会出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸去表面的水分。
两支试管中各加入2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，搅拌使其充分溶解后，向两支试管中分别加入4mL 二苯胺试剂，混匀后沸水溶中加热5min，待试管冷却后，比较两试管的颜色变化，将发现加入DNA的试管中的溶液呈蓝色，从而鉴定DNA的存在。
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
1.样品处理
（1）红细胞的洗涤。洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色液体，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
（2）血红蛋白的释放。红细胞在蒸馏水和40%的甲苯作用下破裂，释放血红蛋白。（3）分离血红蛋白溶液。将混合液进行离心后会分层，第3层的红色透明液体是血红蛋白。
2.粗分离——透析 目的是除去样品中的分子量较小的杂质。
3.纯化——凝胶色谱操作
（1）凝胶色谱柱的制作
（2）凝胶色谱柱的装填
①装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。
②凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现有，必须重装。
③装填完后，立即用300 ml 20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密。
（3）样品的加入和洗脱
①按正确方法加样，不能破坏凝胶面。
②进行洗脱时，等红色的蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集。
4.纯度鉴定——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(选做)
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量,是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
操作关键
（1）制备鸡血细胞液时，要在取新鲜鸡血的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层血细胞沉淀。
（2）获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。
（3）实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3次要取其滤液，使用的纱布为1—2层，第2次是要取其滤出的黏稠物，使用的纱布为多层。
（4）实验中有6次搅拌，除最后一次搅拌外，前5次搅拌要朝向一个方向，并且在析出DNA，DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。
（5）实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，不应少于5min，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了稀释氯化钠溶液。
（6）实验中有三次加氯化钠溶液。在步骤2中，当加入氯化钠后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离，并溶解在氯化钠溶液中。在步骤5中，加氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解，不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的NaCl溶液的浓度比前2次低的多，但还是为溶解DNA。
（7）DNA进一步提纯时选用预冷95%的酒精作用是抑制核酸水解酶活性，防止DNA讲解；降低分子运动，易于形成沉淀；低温有利于增加DNA柔韧性，减少断裂。
（8）本实验成功的关键，是保证提取到足量且较纯净的DNA。因为DNA在细胞中含量少，所以在下列步骤中应特别注意：在步骤1中使用的鸡血的量要在180mL左右。提取细胞核物质时要充分搅拌5min以上。在步骤2中要充分晃动烧杯，在步骤3中加蒸馏水要控制好量，同时应用玻璃棒缓缓搅动使DNA聚集其上。在第4步中要使用多层纱布过滤，在第5步中要充分搅伴，在第7步中使用冷酒精。因为DNA易吸附在玻璃容器上，所以实验中最好使用塑料烧杯和试管，以减少DNA的损失。
（9）盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯和试管最好也是塑料制的，因为玻璃制品表面带电荷，DNA中的磷酸基带相反的电荷，会被吸附于玻璃表面，减少DNA含量。
（10）二苯胺实际要现用现配，否则会影响鉴定效果。
1.洗涤红细胞时，洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。
2.商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需要放在洗脱液中膨胀，为了加速膨胀，可以加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温接近至沸腾，通常需1～2h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内空气。
3.凝胶色谱柱的装填是分离关键之一，装填时要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装填后不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦出现上述现象都需重填。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
4.分离蛋白质时，要求各种蛋白质同时从相同起点开始分离，在凝胶色谱操作中加样时要保证分离样品进入凝胶层后再接通洗脱液，开始洗脱。在电泳操作中，通过浓缩胶的作用，将样品浓缩后再进入分离胶分离。
5.滴加样品时，吸管关口贴管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
2.细胞内DNA复制与PCR技术的比较
比较项目
体内复制
PCR反应
解旋
在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开
80～100℃高温解旋DNA双链全部解开，不需要解旋酶
酶
DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
TaqDNA聚合酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成。再由DNA连接酶连接
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成
温度
体内温和条件
高温
特点
边解旋边复制 半保留复制
体外快速扩增
循环次数
受生物体自身控制
30多次
产物
完整DNA
引物之间DNA片段
相同点
都需要提供DNA模板；以4种脱氧核苷酸(dNTP)为原料；都需要在一定缓冲溶液中进行；子链延伸的方向都是从5′→3′方向
3.PCR操作
项目
PCR操作
用具
微量离心管、微量移液器、DNA扩增仪（热循环仪）、台式高速离心机 、一次性枪头、紫外分光光度计
步骤
（1）准备：按照PCR反应体系配方将所需试剂摆放到实验桌上
（2）移液：用微量移液器按照配方在微量离心管加入各组分
（3）混合：盖严离心管盖子，防止脱落或液体外溅，并用手指轻弹管壁，使反应液混合均匀。
（4）离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s，目的使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。
（5）反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。
（6）测定：用紫外光光度计测定DNA在260nm紫外线的光吸收值，计算DNA的含量。
过程
其原理与细胞内DNA复制相似,但反应体系较简单，其基本过程为：①变性：通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。②退火（复性）：将温度降至引物的50℃左右或以下，引物与DNA模扳互补区域结合，形成杂交链。③延伸： 当反应体系温度升至72℃左右时，DNA聚合酶催化以引物为起始点的5ˊ→3ˊDNA链延伸反应，形成新生DNA链。以上三步为一个循环，每一个循环的产物作为下一个循环的模板,如此循环30次，介于两个引物之间的DNA片段呈指数扩增。
结果
(1)DNA扩增的理论数值
①开始有1条模板，则复制n次有2n条
②开始有m条模板，则复制n次有m×2n条
（2）计算DNA含量。公式：DNA含量(
g)=50×（260nm的读数）×稀释倍数。
成功关键
（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸气灭菌。
（2）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心臂放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中 进行反应。
有关问题
1.DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从
3′端延伸DNA链。
2.当PCR体系的温度有变性后快速冷却到50℃左右时，引物与模板可结合，一般不需考虑解开的两个DNA链的重新结合，原因是：
（1）模板DNA比引物长得多，而且复杂得多，不易重新结合。
（2）引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间碰撞。
（3）加入的引物的量足够大而模板链数量少。
高考要求
实 验
要 求
（1）DNA粗提取与鉴定
（2）PCR技术的基本操作和应用
（3）蛋白质的提取和分离
掌握程度参考本考试大纲中的：
一、考核目标与要求
2．实验与探究能力
知识整合
1.DNA与蛋白质提取分离与鉴定比较
比较项目
DNA粗提取与鉴定
血红蛋白的提取和分离
实验方法
盐析法、酒精沉淀法和显色法
凝胶色谱法和电泳法
实验原理
1.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同（如图）：
在2mol/LNaCl溶液中，DNA溶解，部分蛋白质盐析生成沉淀，过滤可除去部分蛋白质；在0.14mol/LNaCl溶液中时，DNA析出，过滤可除去部分蛋白质。
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理可将DNA与蛋白质进一步分离。
3.利用DNA遇二苯胺（沸水浴）成蓝色的特性，可以鉴定提取的DNA
1. 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，通过的路程短，移动速度快；相对分子质量小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程长，移动速度慢。因此，样品中相对分子质量大的蛋白质先流出，相对分子质量小的分子后流出。因此得以分离。
2. 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可解离基团，它们在某个特定的pH下会带上正电或负电；在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极方向移动。电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的的。
实验步骤
1.实验材料的选取
一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难。实验中一般选用鸡血或菜花作为实验材料，不选择哺乳动物的血细胞，因为其红细胞无核，很难提取到DNA。
2.破碎细胞，获取含DNA的滤液
以动物细胞为实验材料时，破碎细胞较容易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。以植物细胞为材料时，充分研磨破坏了细胞壁，洗涤剂中的表面活性剂成分能够与膜蛋白结合从而破坏细胞膜，这些为核DNA的释放提供了通道。同时要加入食盐使DNA溶解，便于提取。
3.去除滤液中的杂质
根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开。
（1）利用DNA在不同NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。
（2）直接在滤液中加入嫩肉粉，使嫩肉粉中的木瓜蛋白酶分解蛋白质。
（3）将滤液放入60℃～75℃的恒温水浴箱中保温10～15min，注意严格控制温度。
4.DNA的析出与鉴定
在滤液中加入冷却的无水乙醇，并用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，由于 DNA不溶于酒精，会出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸去表面的水分。
两支试管中各加入2mol/L的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，搅拌使其充分溶解后，向两支试管中分别加入4mL 二苯胺试剂，混匀后沸水溶中加热5min，待试管冷却后，比较两试管的颜色变化，将发现加入DNA的试管中的溶液呈蓝色，从而鉴定DNA的存在。
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
1.样品处理
（1）红细胞的洗涤。洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白。采用低速短时间离心，吸出上层透明的黄色液体，再加入五倍体积的生理盐水，重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。
（2）血红蛋白的释放。红细胞在蒸馏水和40%的甲苯作用下破裂，释放血红蛋白。（3）分离血红蛋白溶液。将混合液进行离心后会分层，第3层的红色透明液体是血红蛋白。
2.粗分离——透析 目的是除去样品中的分子量较小的杂质。
3.纯化——凝胶色谱操作
（1）凝胶色谱柱的制作
（2）凝胶色谱柱的装填
①装填前，凝胶用蒸馏水或者洗脱液充分溶胀。
②凝胶装填要均匀，色谱柱内不能有气泡，一旦发现有，必须重装。
③装填完后，立即用300 ml 20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密。
（3）样品的加入和洗脱
①按正确方法加样，不能破坏凝胶面。
②进行洗脱时，等红色的蛋白质接近色谱柱底端时，采用试管收集。
4.纯度鉴定——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(选做)
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量,是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的负电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质分子相对迁移率的大小完全取决于分子量的高低，因此可从已知分子量的标准蛋白质的对数和相对迁移率所作的标准曲线中求出供试品的分子量。
操作关键
（1）制备鸡血细胞液时，要在取新鲜鸡血的同时加入抗凝剂，使血液分层，取下层血细胞沉淀。
（2）获取较多DNA的关键是向鸡血细胞液加入足量的蒸馏水，以便使细胞膜和核膜破裂，核内物质释放出来。
（3）实验中共有3次过滤。过滤时使用的纱布层数与取其滤液或黏稠物有关。第1、3次要取其滤液，使用的纱布为1—2层，第2次是要取其滤出的黏稠物，使用的纱布为多层。
（4）实验中有6次搅拌，除最后一次搅拌外，前5次搅拌要朝向一个方向，并且在析出DNA，DNA再溶解和提取中，各步搅拌都要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，防止DNA分子断裂。
（5）实验中有两次使用蒸馏水。一次在第1步，加水是为了使血细胞吸水膨胀破裂，加水后必须充分搅拌，不应少于5min，使血细胞充分破裂；第二次加蒸馏水是在第3步，加水是为了稀释氯化钠溶液。
（6）实验中有三次加氯化钠溶液。在步骤2中，当加入氯化钠后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离，并溶解在氯化钠溶液中。在步骤5中，加氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解，不过这时溶液中蛋白质含量已很少。在步骤8中，加的NaCl溶液的浓度比前2次低的多，但还是为溶解DNA。
（7）DNA进一步提纯时选用预冷95%的酒精作用是抑制核酸水解酶活性，防止DNA讲解；降低分子运动，易于形成沉淀；低温有利于增加DNA柔韧性，减少断裂。
（8）本实验成功的关键，是保证提取到足量且较纯净的DNA。因为DNA在细胞中含量少，所以在下列步骤中应特别注意：在步骤1中使用的鸡血的量要在180mL左右。提取细胞核物质时要充分搅拌5min以上。在步骤2中要充分晃动烧杯，在步骤3中加蒸馏水要控制好量，同时应用玻璃棒缓缓搅动使DNA聚集其上。在第4步中要使用多层纱布过滤，在第5步中要充分搅伴，在第7步中使用冷酒精。因为DNA易吸附在玻璃容器上，所以实验中最好使用塑料烧杯和试管，以减少DNA的损失。
（9）盛放鸡血细胞液的容器和实验中的烧杯和试管最好也是塑料制的，因为玻璃制品表面带电荷，DNA中的磷酸基带相反的电荷，会被吸附于玻璃表面，减少DNA含量。
（10）二苯胺实际要现用现配，否则会影响鉴定效果。
1.洗涤红细胞时，洗涤次数过少，无法去除血浆蛋白；离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，达不到分离的效果。
2.商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需要放在洗脱液中膨胀，为了加速膨胀，可以加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温接近至沸腾，通常需1～2h。这种方法不但节约时间，而且可以除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内空气。
3.凝胶色谱柱的装填是分离关键之一，装填时要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。装填后不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦出现上述现象都需重填。如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
4.分离蛋白质时，要求各种蛋白质同时从相同起点开始分离，在凝胶色谱操作中加样时要保证分离样品进入凝胶层后再接通洗脱液，开始洗脱。在电泳操作中，通过浓缩胶的作用，将样品浓缩后再进入分离胶分离。
5.滴加样品时，吸管关口贴管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。
2.细胞内DNA复制与PCR技术的比较
比较项目
体内复制
PCR反应
解旋
在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分DNA双链解开
80～100℃高温解旋DNA双链全部解开，不需要解旋酶
酶
DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
TaqDNA聚合酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成；另一条链不连续合成。再由DNA连接酶连接
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成
温度
体内温和条件
高温
特点
边解旋边复制 半保留复制
体外快速扩增
循环次数
受生物体自身控制
30多次
产物
完整DNA
引物之间DNA片段
相同点
都需要提供DNA模板；以4种脱氧核苷酸(dNTP)为原料；都需要在一定缓冲溶液中进行；子链延伸的方向都是从5′→3′方向
3.PCR操作
项目
PCR操作
用具
微量离心管、微量移液器、DNA扩增仪（热循环仪）、台式高速离心机 、一次性枪头、紫外分光光度计
步骤
（1）准备：按照PCR反应体系配方将所需试剂摆放到实验桌上
（2）移液：用微量移液器按照配方在微量离心管加入各组分
（3）混合：盖严离心管盖子，防止脱落或液体外溅，并用手指轻弹管壁，使反应液混合均匀。
（4）离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10s，目的使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。
（5）反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应。
（6）测定：用紫外光光度计测定DNA在260nm紫外线的光吸收值，计算DNA的含量。
过程
其原理与细胞内DNA复制相似,但反应体系较简单，其基本过程为：①变性：通过加热至95℃左右，使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA，作为反应的模板。②退火（复性）：将温度降至引物的50℃左右或以下，引物与DNA模扳互补区域结合，形成杂交链。③延伸： 当反应体系温度升至72℃左右时，DNA聚合酶催化以引物为起始点的5ˊ→3ˊDNA链延伸反应，形成新生DNA链。以上三步为一个循环，每一个循环的产物作为下一个循环的模板,如此循环30次，介于两个引物之间的DNA片段呈指数扩增。
结果
(1)DNA扩增的理论数值
①开始有1条模板，则复制n次有2n条
②开始有m条模板，则复制n次有m×2n条
（2）计算DNA含量。公式：DNA含量(
g)=50×（260nm的读数）×稀释倍数。成功关键
（1）为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸气灭菌。
（2）在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀，再将微量离心臂放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管底部，再放入PCR仪中 进行反应。
有关问题
1.DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从
3′端延伸DNA链。
2.当PCR体系的温度有变性后快速冷却到50℃左右时，引物与模板可结合，一般不需考虑解开的两个DNA链的重新结合，原因是：
（1）模板DNA比引物长得多，而且复杂得多，不易重新结合。
（2）引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间碰撞。
（3）加入的引物的量足够大而模板链数量少。