景爱梅多大:细胞培养基本技术（免疫细胞分离、肿瘤细胞株传代培养）

作者：（张卓然、孟庆丽… 来源：生物秀 时间：2006-12-11
细胞培养（Cell Culture）专题：
http://ask.bbioo.com/special/experiment/cellculture.htm
一、免疫细胞分离技术
1、淋巴细胞的分离
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀释后，沿管壁徐徐滴流叠加盛有2m1 淋巴细胞分离液的试管内(注意勿与分离液混合，然后2000r／min 水平离心20min，管内分为4 层，自上而下依次为血浆，单个核细胞，颗粒白细胞、红细胞(图2—1)。用毛细管伸至单个核细胞层中(位于细胞分离液与血浆的界面上)，沿管壁轻轻吸出全部细胞。然后用Hanks 液洗两次，每次2000r／min 离心10min，最后用RPMI l640 培养液将细胞配成2×106／m1 的细胞悬液备用。
2、T 细胞及B 细胞的分离
将淋巴细胞悬液通过尼龙棉柱，B 细胞粘附于尼龙棉上，T细胞则不粘附，先用RPMI l640 培基洗脱尼龙棉柱，流下的细胞悬液含有丰富的T 细胞。然后用力反复挤压尼龙柱、挤出粘附在尼龙棉上的B 细胞，并用少量的RPMI l640 培基洗脱，此细胞悬液含有丰富的B 细胞。尼龙柱(塑料管)的长短和尼龙棉的多少，视分离细胞的多少而定。
3、CD4 细胞及CD8 细胞的分离
（1）CD4 细胞的分离：将一定量的T 细胞悬液通过一根SephDdexC—10 柱，然后用少量的RPMll640 培养洗涤，收获的细胞悬液约含85％的CD4 细胞。
（2）CD8 细胞分离：用Tris 缓冲液稀释羊抗鼠IgG(浓度为10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃过夜，没有包被上的抗体用PBS 洗净。然后将已标记有抗CD8 单克隆抗体的T 细胞(细胞浓度为1×l07／m1)3m1 加入上述的平皿内，4℃放置2 小时，用PBS 轻轻洗净末粘附的细胞，然后用毛细管加入10m1 PBS 吹打。收集的脱落细胞经洗涤后悬浮在RPMI l640 培基中备用。CD4 细胞亦可用此法分离。
4、单核巨噬细胞的分离
单核巨噬细胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴细胞则无此特性，借此可将这两类细胞分开，其方法简述如下。将待分离的细胞悬液(如实物动物的腹腔液)加入适当大小的塑料或玻璃平皿内，置于37℃ C02 温箱内温育1 小时，然后用RPMI 1640 培基轻轻漂洗平皿表面，去除非粘附细胞，再将粘附有细胞的平皿表面用上述培基轻轻洗刷，收集粘附的单核巨噬细胞。如果要获得纯度较高的单核巨噬细胞，可重复上述过程。
二、肿瘤细胞株的传代培养
传代细胞是指来自人或动物的肿瘤组织或正常组织的细胞，其染色体组型发展为非整倍体或二倍体低于75％，这种非整倍体细胞在体外具有无限传代的生命力，通常具有异种移植的能力和较广泛的病毒敏感性。传代细胞的特性是：①具恒定繁殖特性，少数细胞即有繁殖能力，在琼脂内能形成克隆；有的为贴壁生长，有的悬浮生长。②染色体组型为异倍体，大多数人源细胞染色体为60－70 条左右。③保留种属特异性，但组织分化性与脏器特性均消失。④具致癌性。由于传代细胞繁殖迅速，易获取、易保存，已为各实验室广泛采用。
1、HeLa 细胞的传代培养
试剂与仪器
●HeLa 细胞。
●Hanks 液，0．25％胰蛋白酶，0．02％EDTA，生长液，青、链霉素(PS)，5．6％NaHCO3
●小三角烧瓶，培养瓶，无菌吸液管(5m1 及1m1)、毛滴管，废液瓶等。
方法与步骤
（1）选生长良好的HeLa 细胞一瓶，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起浮着在细胞表面的碎片，然后连同生长液一起倒出，用Hanks 液洗一次。
（2）从无细胞面侧加入0．25％胰蛋白酶液或胰蛋白酶一EDTA 消化液4－5ml，翻转培养瓶，使消化液浸没细胞1min 左右。
（3）翻转培养瓶，放置5—10min，为促进细胞的消化，可以加入37℃预热的消化液，或在细胞面向上时，用手掌贴着细胞面的瓶外壁，待肉眼观察细胞面出现布纹孔状为止。
（4）倒出消化液，如系EDTA 消化，需沿细胞层的对面加Hanks 液4．5m1 洗涤，洗涤时轻轻转动培养瓶，让液体在瓶内慢慢流动，以洗掉消化液；如系胰蛋白酶消化，倒掉胰酶后可不洗涤。
（5）沿细胞面加入适量新配制的生长液，洗下细胞，并用吸管吹打数次，使细胞分散开，按1：2 或1：3 分配传代培养。
（6）37℃培养，接种后30min 左右可贴壁，48 小时可换生长液，一般3—4 天可形成单层，形成单层后再换维持液供试验用。
[附]
（1）生长液：
①MEM 液63％，乳蛋白水解物20％
小牛血清 15％ 双抗(P、S)1％
用5．6％ NaHCO3 溶液调整pH 至7．2—7．4
②199 液 70％ 乳蛋白水解物 18％
小牛血清 10％ 双抗(P、S) 1％
用5．6％NaHCO3 溶液调pH 至7．2－7．4 。
③1640 液 88％ 小牛血清 10％
双抗(P、S) 1％ 用5．6％NaHCO3  溶液调pH 至7．2－7．4
（2）维持液
1640 液 96％ 小牛血清 2％
双抗(P、S) 1％ 用5．6％NaHCO3 溶液调pH 至7．2－7．4
2、人类白血病细胞(K562)的传代培养
试剂与仪器
●K562 细胞。
●RPMI l640 生长液。
●培养瓶、无菌吸液管(5m1 及1m1)、废液瓶等。
方法与步骤
（1）选生长良好的K562 细胞一瓶，轻轻加入等量的生长液。
（2）用无菌吸液管轻轻吹打，使K562 细胞均匀悬浮，然后吸出一半的细胞悬液加入另—个培养瓶中。
（3）37℃，5％C02 孵箱中培养24—48h。
（4）如果细胞比较浓，可按1：3 分配传代培养。
三、细胞的计数、分装与培养
1、细胞计数
细胞计数对于决定植入的细胞浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度都是极为重要的。
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首先取待测的细胞悬液0．1ml 加D—Hanks 液0．8m1 及0．3％台盼蓝0．1mI(死细胞着色)，混合后滴入血球计数盘内，按白细胞计数法，于低倍镜下计数4 角的4 个大方格内的活细胞(透明未着色)总数，然后用下式计数：
在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左不数石的原则进行计数。计数时，二次重复计算误差不应超过10％。
2、细胞的分装与培养
根据细胞计数，用生长液将细胞悬液稀释成(3—5)×105个／m1，每个培养皿内分装一定量。一般接种细胞数应视细胞种类不同而定，如类上皮细胞浓度应为(1－3)×105／m1，成纤维细胞应倍量[(2－6)×105／ml。若为胚胎组织细胞，细胞数量可低些，而成体组织细胞数量则应高些；细胞活力好的接种数可少些，年老组织接种的量就应多些。如对制各细胞的成活率把握不大，可先取少量分装试培养，次日抽样检查。如细胞成活，细胞贴壁，即可大量分装培养；如细胞不贴壁，则将制备的细胞弃掉需重新制备。一般通过细胞活性检测或视制备中的细胞性状等，对接种的成功率应心中有数，故实际中少量试装培养可省略。
37Y 孵箱静置培养，于2—3 天后换一次生长波，类上皮细胞约在5－7 天可长成单层细胞，成纤维细胞则以3－4 天或5－7 天为宜，以供使用。已铺满瓶皿底面的单层细胞，如继续培养则易老化，甚至脱落。感染病毒等影响特异性CPE 的判断，因此成片细胞不能当天使用，应换成维持液(不含或仅含2％以下血清的培基)，以后每隔5—7 天换维持液一次，一般可维持1—3 周，用这种维持细胞进行试验研究。
这种长成单层的原代细胞可进行传代培养用细胞分散剂(胰酶、EDTA 或胰酶／EDTA 等)处理，使细胞从培养皿上脱离，加生长液充分吹打，制成单个细胞悬液分装。加入生长液的量可按原量的2 倍，即一瓶传成二瓶，置37℃培养3－5 天可形成单层，成片后换维持液即可进行试验。
四、细胞的冻存、复苏与运输
细胞培养（Cell Culture）专题：
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