水乙二醇比热容对照表:药物敏感试验的细胞培养法

用体外细胞培养法研究药物的作用，观察各种药物及其不同剂量对离体细胞的作用，可作为机体使用时的参考。

一、细胞培养在药物敏感试验中的作用

采用细胞培养法不仅了可以检查细胞系（株）对药物的敏感性，而且还可做体内和体外敏感性的比较，同时也可观察不同药物所引起的体外细胞形态结构和生理、代谢的变化，如铵盐和腺苷均可使细胞浆内形成空泡；脓绿素可增加细胞对氧的吸收，抑制细胞核的分裂；一定剂量的复方丹参能阻碍细胞贴壁，可影响人食管癌细胞对基质的附着作用，故有“活血化瘀”的疗效。有些药物时细胞核分裂的毒物，如吖啶黄、秋水仙素与肾上腺素。吖啶黄可使细胞在核分裂时形成染色“桥”，使已分裂的两个细胞不能完全分开。秋水仙素可以抑制细胞纺锤体的活动，是有丝分裂中控制细胞分裂中期染色体图像的有效药物。肾上腺素可以引起细胞核的分裂异常。

利用细胞培养法进行抗癌药物的研究不仅可以帮助解决药物的机制问题，而且可以精确地测定和计算出各种药物的有效作用浓度，如半数抑制浓度（IC50）;半数致死浓度（LD50）等对临床治疗均有一定的参考价值。

试验中应注意的问题：

●有的药物在体外试验时无致癌性，进入体内在某些酶的激活下可产生致癌作用，另外还存在着癌细胞耐药性问题。

●一般来说，细胞培养比较适用于单质药物测试，在用复方药或中药进行试验时，由于药物成分多，加上每批药物之间可能存在着质和量上的差异，评价时应考虑这些因素，持客观而谨慎的态度。

●非水溶性药物测试的溶剂，应设溶剂对照组，以排除溶剂作用。

二、药物敏感试验方法

（一）药物的准备

一般试验均以100倍浓缩液做储备液，根据不用药物可以用生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖盐水融解和稀释，但有的需用75%酒精或二甲基亚砜等有机物溶剂进行融解，但这种溶剂在细胞培养基总浓度不宜过大，一般为0.5%-1%，以防止溶剂对细胞产生毒性作用而影响细胞生长，不同的药物储备液应妥善保存在合适的环境和条件下，有的需暗藏，有的需低温保存。有的甚至需达-70℃以下药物才可获得稳定保存，如细胞因子药物。

体外药物敏感性试验所用的药物浓度，一般为临川血浆高峰浓度的0.1倍及10倍为宜。

试验时既要有阴性对照，又要有阳性对照，稀释药物要呈5-7个对数级浓度，所用药物的浓度选择亦有差异，但试验中应先做预实验来选定。同时要选择合适浓度以避免非特异作用所产生的假阳性的结果。药物作用时间可因试验方法而异，短期法，如测NKCF只需4-5h，中期法如MMT法测细胞因子活性需4-6天，长期打如集落形成试验造血细胞因子则需2-3周等。

（二）受试细胞的准备

根据实验目的可选用体外培养的肿瘤细胞系（株），如国内外确认的稳定细胞系（株），也可以用肿瘤患者的新鲜手术肿瘤标本，后者需采用机械分散法或酶消化法等分离技术，分离出肿瘤细胞悬液，血液系统肿瘤患者可取外周血或骨髓标本分离单个核细胞（MNC），制成悬液，以供试验用。原则上要选用对药物能产生特定作用的细胞种类，其一致性和符合性越大越好，若人源细胞不能获得，可用哺乳动物细胞。

（三）药效的评价

1、体外抑瘤试验

合成化合物或植物提取物纯品的IC50<10ug/ml，或植物粗提物的IC50<20ug/ml，并且有细胞毒性的剂量依赖性关系，其最高抑制效应达80%以上，发酵液IC50应大于1：100，则判定样品在体外对细胞有杀伤作用，同时应设有阴性对照和阳性对照药物以排除实验系统的误差，同时要有正常二倍体细胞与癌细胞作对照，以判定抗癌作用的药效特异性。

2、已被抑瘤试验

实体瘤的疗效以瘤重抑制率表示

（四）体外药物对肿瘤细胞的敏感试验

1、美蓝法

其原理是利用活细胞的脱氢酶提供氢离子，使甲烯蓝（美蓝）还原为甲烯白（无色），细胞死亡之后，脱氢酶失活，无法使甲烯蓝还原，因此被染成蓝色，检测用药后的死细胞数能反映药物的抑瘤作用。

2、染料排除法

根据活细胞在低浓度染液中不着色的特点，一般用0.2%台盼蓝或0.1%伊红染料，当药物导致细胞死亡时，细胞膜通透性增加，致使染料进入胞内而着色，加药后计算着色细胞数，以示药效，由于某些濒临死亡的细胞不宜着色，故假阴性率较高。

3、生长曲线测定法

癌细胞在最适条件下呈指数生长，当细胞处于对数生长期时用于试验，以细胞数的对数与培养时间可得一条生长曲线，比较加药组合对照组细胞生长曲线，可反映出药物对肿瘤细胞生长的影响。本实验可获得3方面的数据。

（1）药物对细胞生长的抑制率：将对照组及加药组细胞生长曲线的线性部分延伸至Y轴，可分别得到载距N0及N0/。它们分别代表两组接种后具有增值能力的细胞数。

（2）药物对倍增时间（TD）的影响：以t代表培养时间，N0及Nt分别代表接种时刻及经培养t小时后的细胞数，按公式计算倍增时间，如果药物组倍增时间延长表明药物使细胞增值能力减弱。

（3）药物对细胞生长饱和密度（NS）的影响：取处于生长稳定期的培养细胞，计算单位面积或体积的细胞均数，即为细胞生长达饱和的密度，此数值减小也表示细胞增殖活性减弱。

4、集落形成试验法

肿瘤细胞与造血干/祖细胞一样，含有极少部分具有自我复制和增值能力的干细胞，具有分化和形成集落的特性，肿瘤细胞干细胞可为放射治疗和化疗药物治疗的靶细胞，它与肿瘤的治愈、复发或转移关系密切。造血干/祖细胞与机体造血功能及经放化疗后患者骨髓抑制状态的恢复和造血功能的重建也密切相关，故集落形成试验既可作为体外检测抗癌药物对肿瘤细胞敏感性的试验方法，又可作为抗癌药物所产生的患者骨髓抑制的恢复和造血功能重建的重要手段。并可对患者的骨髓造血状态进行动态观察。

（1）肿瘤干细胞集落形成试验：

根据公式计算肿瘤细胞干细胞集落抑制率。

在半对数纸上以集落抑制率与计量对数作图，可以得到一条S形曲线并求出药物的IC50值，或者求出集落存活分数（S）.

以集落存活分数的对数与计量作图，可以得到细胞存活曲线，由于药物对细胞杀伤作用一般遵循一级动力学，即一定量的药物杀死一定百分比的细胞，故存活曲线呈带肩区的斜率的向下的直线，其方程为S=1-(1-e-D/D0)n，S为存活分数，D是药物剂量，D0是存活分数在细胞存活曲线中直线部分下降63%所需的剂量，n是曲线指数部分外延至Y轴的截距，称为推值。D0越小，敏感性越高。n反映细胞对药物引起的损伤的修复能力，n越大，表示杀死细胞所需的药物阈剂量越大。

集落形成法与临床结果阳性符合率约为60%-70%，阴性符合率为90%-95%，本法尚存在许多问题：a、难获得真正的单个肿瘤细胞悬液（因经消化分散获得）；b、集落形成效率低；确定集落有一定难度；耗时长，且重复性差。

（2）造血干/祖细胞的集落形成试验：

造血干/祖细胞在骨髓中最丰富，通常取骨髓标本来进行集落形成试验，故又称骨髓细胞集落形成法。

无菌抗凝取骨髓标本，用淋巴细胞分层液分离获得骨髓中单个核细胞，用洗液洗3次，培养基洗1次后，以（3-5） x 104个/ml浓度接种含0.3%-0.4%软琼脂的培养板中，37℃、5%CO2培养7-14天或2-3周后在倒置显微镜下计≥40个细胞的集落形成数，然后按下式算出集落刺激活力（CSA）。

5、MTT比色法

该方法是一种细胞活力的检测方法，活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可使外源的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉淀于细胞中，而死细胞无此功能，可用二甲基亚砜、异丙醇或10%酸化SDS将颗粒溶解，用酶标仪在570nm波长处测OD值，可间接反映活细胞的数量，该法用于细胞因子生物活性检测，抗肿瘤药物及肿瘤放射敏感性及细胞毒试验的测定。

●用0.25%胰蛋白酶消化法制备肿瘤细胞悬液，用含10%小牛血清的RPMI培养基调整细胞浓度为105个/ml，于96孔板中每孔加100ul，培养24h后加不同剂量药物100ul/孔，设阴性对照组，阳性对照组和调零孔，每组4个平行孔。

●37℃、5%CO2下继续培养24-48h，实验终止前，每孔加入MTT溶液，用酶标仪检测570nm处的OD值，以不加药的阴性对照组570nm处的OD值均数作为对照，根据公式计算细胞存活率及药物对细胞的抑制率。

6、放射性同位素掺入法

常用3H-TdR或 3H-UdR掺入处于DNA或RNA合成期的细胞，活细胞可掺入，死细胞不能掺入，可用液体闪烁计算仪测知3H-TdR或 3H-UdR含量，通过与不加药对照组比较，从而可了解药物对肿瘤细胞DNA或RNA合成的抑制效应。

●取对数期生长期的肿瘤细胞用0.25%胰蛋白酶消化分散制成单个细胞悬液，调整细胞浓度为2 x 105个/ml，于24孔板中接种0.5ml、96孔板中接种50ul，培养24h后，每孔加入不同剂量的药物，并设有不加药的阴性对照组，每组4个复孔。

●37℃、5%CO2下继续培养24-48h，使药物发挥作用，在试验终止前加入3H-TdR，每孔1ml或100ul继续培养4-24h，终止反应和培养。

●弃去旧液，并用Hanks液漂洗2-3次，以除去上清中的同位素，然后加入预冷的10%三氯醋酸（TCA），放置10min，如果细胞松散，应先用甲醇固定10min，再用10%TCA重复2次，每次5min。

●每孔加入0.5ml 0.3mol/L的NaOH，在60℃处理30min，然后再冷至室温，收集上述各孔的裂解液，移入已加液的闪烁瓶中。

●用液体闪烁计算仪测定每分钟脉冲数（cpm），用公式计算细胞抑制率。

7、抗癌药物的效能比测定法（CFU-F测定法）

肿瘤化疗常见副作用是药物对正常组织的毒性，对增殖较快的造血细胞和组织的毒性尤为常见，造血细胞增值活性高，往往是抗癌药毒性的主要靶细胞，因此通常选用造血细胞作为正常细胞的代表来测定抗癌药物的效能比，在体外同时测定药物对癌细胞及正常人细胞的细胞毒作用，并计算出该药在细胞水平上效能比。

骨髓基质主要由成纤维细胞、内皮细胞及巨噬细胞等组成，在骨髓细胞培养早期，造血细胞逐渐衰退消失，巨噬细胞增多，呈圆球形，第6天有小的成纤维细胞形成集落出现，贴壁生长至第9天，细胞增殖呈现明显的集落，每一个集落通常称为成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）。随着培养时间的延长和不断换液，可相互交错连接成单层，培养基用RPMI并加入20%小牛血清进行CFU-F测定。

①骨髓细胞悬液的制备，取小鼠3-5只，在无菌条件下取股骨，用培养基冲洗骨髓，将细胞分别通过6号、4号针尖，使之分散成单个细胞悬液，经计算后，计算有核细胞数，用培养基调整细胞浓度为5 x 106个/ml。

②成纤维细胞集落培养。将上述制备好的细胞悬液分瓶培养，分成不加药的对照组和加入不同剂量药物的实验组，共同于37℃、5%CO2下培养，每隔3-4天半量换液或加液。

③9天后取出，弃去上清，并用PBS洗，轻轻振摇后倒去洗液。共洗3次，以尽量除去非贴壁的细胞，然后用甲醇固定10min后，用吉姆萨染色15min，水洗，干燥后于倒置显微镜下计数，以10个以上成纤维细胞为一个成纤维细胞集落形成（CFU-F）。按公式计算CFU-F集落形成抑制率。

三、不同抗癌药物的生物效应指标的选择

一些抗癌药物常用的药敏试验方法，主要是根据这些抗癌药物对癌细胞生长抑制或杀死癌细胞的机制设计的。但并非所有抗癌药物均是如此，有些抗癌药物并不能直接抑制癌细胞生长或杀死癌细胞，产生细胞毒作用，而是通过免疫系统的活化和对内分泌系统的调节效应来间接发挥抗癌效应，如免疫促进剂、调节剂及补气益气类中药成分，就要预先给药，通过测试药物促进免疫应答的细胞免疫功能和免疫分子的分泌，以及对神经-内分泌系统的调节作用来证实抗癌效应。由此可见药物的抗癌作用的细胞生物学效应各不相同，必须根据不同药物选用相应的指标。

1、生物化学成分

有的药物对细胞功能的作用常表现在对某种成分或因子的合成发生抑制（如DNA、胶原）或促进（如抗癌相关的细胞因子，免疫效应分子、受体、激素、神经肽等）上，这时就要检测这些成分在细胞内或培养基中的含量（或效价），即可知药物的效应，测定对蛋白或酶作用，可用ELASA、组织化学法、免疫组化及电泳法、生物活性检测法以及流式细胞仪检测法等测定。

2、形态结构

细胞受药物作用后，形态上容易发生改变，但这种形态变化不十分可靠，还需观察药物对细胞膜微绒毛、内质网、细胞核的核仁和染色质等微细结构的影响。

3、生长和增殖

生长是指细胞体积增大，增粗或增长，细胞数量不变，增殖是指细胞通过细胞分裂，使数量增多，分裂指数是常用来测定细胞增殖的方法。值得注意的是培养中的细胞可能仅有生长而无增殖，特别是进行细胞分化试验更是如此。因此不能单靠细胞数量作为判定药物效应的唯一指标，其他一些现象如肌细胞的增粗、神经细胞突起的增长、淋巴细胞的转化，均为药物作用后所产生的生物效应的表现。

4、细胞死亡

致死效应是药物（特别是抗肿瘤药物）检测中重要的指标。细胞死亡是一个很复杂的过程，有的常发生程序性死亡（即凋亡），死亡和凋亡有程度上的差异。死亡是指细胞裂解，脱壁，溶解等，这在显微镜下就可观察到，而凋亡虽然是细胞死亡的一种主要形式，但并非唯一的形式，往往细胞并不死亡，但功能代谢紊乱，导致细胞功能障碍，分裂指数下降，失去分裂能力，或细胞器及DNA发生改变，使细胞处于濒临死亡的状态，最后会产生缓慢死亡现象，这些都应视为细胞死亡的范畴，这种死亡在显微镜下难以测出，如氰化物抑制细胞氧化磷酸化，阻断ATP供应，氯霉素干扰蛋白质合成并抑制细胞修复，某些化疗药物可使某些细胞处于程序性死亡的阶段。这些作用都有一个发展过程，最终导致细胞死亡，因此确定细胞死亡必须有一个时间范围，同时还应测试程序性死亡(凋亡)各项指标。

值得注意的是，用培养癌细胞检测抗癌药物获得的体外试验结果，仅视为受检药物效应的了解和做进一步试验的参考，不能作为临床应用的直接依据。确证药物抗癌效应，尚须做动物试验及I期、II期、III期临床验证后，方可作出确切的综合判断。