南京 王树宏:核酸免疫与核酸疫苗

　　1 核酸免疫的作用机理

　　目前对核酸免疫作用机理的认识还多限于理论推测，且多数资料来自于基因治疗试验。在基因免疫中，含病原体抗原基因的核酸疫苗被导入宿主细胞，被周围的组织细胞、APC细胞或其他炎性细胞摄取，在细胞内表达。表达产物作为抗原可能的传递途径是：肌细胞直接摄入或经T小管和细胞样内陷摄取进入，在外源基因启动于作用下使外源基因表达，使产物在胞内水解酶的作用下分解成长短不一的多肽，其中的一部分被hsp70运到内质网，经网膜上的TAP分子转入膜内与主要组织相容性复合物（MHC）I类结合，最终在细胞膜表面被CD+8细胞识别；另一部分短肽进入溶酶体，与 MHC Ⅱ类分子结合，运到细胞表面被CD+4细胞识别。这些多肽含有不同的抗原表位，它们将诱导细胞毒性T淋巴前体、B细胞和特异性辅助T细胞产生细胞免疫和体液免疫。同时，基因表达可以通过细胞分泌和分裂的方式进人组织细胞间隙，以天然折叠方式被B淋巴细胞识别。

　　核酸免疫后，还可以使肌细胞和抗原传递细胞被感染，从而使CD+4和 CD+8细胞亚群活化，产生特异的免疫应答。Corr M等（1996）研究表明，从转染DNA的肌肉组织释放出的抗原被APC摄入，运送到管状淋巴结中，在B淋巴细胞和T淋巴细胞表达，Ⅰ类MHC限制的CTL应答可能主要以这种方式产生。以前曾认为该过程需要内源抗原的表达，但现在的研究表明，只要有外源抗原的存在，也能有效地引起Ⅰ类MHC限制的CTL应答。

　　最近还有研究表明，DNA重组技术可提供一种能产生大量用做疫苗的特异性抗原的新途径（刘文波等，2001）。这在原核细胞中已完成了许多基因的克隆和表达，但其细胞产物的免疫原性一般不太满意。在某些情况下，原核细胞不能修饰蛋白质（如糖基化），并被认为是导致低免疫原性的原因。但嵌合基因的表达，可导致“外来”肽与载体蛋白融合，从而增加外来肽的免疫原性。因此，增强重组细菌产物免疫原性的途径，可以通过产生融合蛋白来实现。

　　2 影响核酸免疫效果的主要因素

　　2．1 目的基因的选择目的基因即疫苗DNA的构建和选定，这是决定核酸免疫效果的关键。最好选择病毒的主要保护性抗原基因。殷震（1998）指出，构建同一病毒不同基因的融合基因或分别构建各个基因各自的表达质粒后，进行联合接种，常可收到最佳的免疫保护效果。

　　2．2 载体质粒及启动子的选择载体质粒的种类及其结构组成对核酸免疫的水平有明显影响。研究发现，表达载体能否在哺乳动物细胞中高水平表达，启动子是很关键的，启动子主要有CWi、BSV、SV40、MMTV－LTR、ALV－LTA等。研究指出，含CMV、RSV的载体表达水平较高，更适用于核酸疫苗。

　　2．3 接种方法及途径Fynan等（1993）进行了不同方式核酸免疫效果比较，结果发现用基因枪接种比直接注射核酸疫苗效果好600～6000倍。研究还表明，肌肉注射保护效果比鼻腔内、腹腔内。静脉内和皮肉内免疫效果都好。

　　2．4 接种部位的预处理试验表明，用25％高渗蔗糖或甘油在核酸接种前预处理接种部位，比如肌肉，可使疫苗DNA的表达水平提高。而且，先给接种的肌肉部位注射蛇毒或局部麻醉剂，然后再做核酸疫苗的注射，也可提高表达水平。

　　2．5 接种剂量和次数许多研究表明，免疫应答强度和免疫保护与接种剂量和次数有一定的相关性。而且，提高接种剂量能否提高体液或／和细胞免疫，是随着抗原基因的种类不同而变化的。对于无毒性的表达蛋白，应采用较高剂量和较多接种次数，这将产生较高水平的表达蛋白和抗体。但对于毒性蛋白的表达，可能过早杀死转染细胞，阻断转染细胞继续产生抗原，以致不能维持免疫刺激，从而呈现负面效应。因而，在这类毒性蛋白中，最好不要设计和应用高表达载体，如5端含有内含子的CMV启动于。

　　2.6 增强剂和佐剂的应用细胞因子基因，如TNF、GM－CSF、IFN以及IL一2、IL－4和IL－12等，在与核酸疫苗共同接种时，常能明显提高体液和细胞免疫反应，例如与艾滋病病毒（HW－l）DNA共同接种的TNF和IL－2基因就能显著加强细胞毒性反应，但是，细胞因子基因在与疫苗DNA共同接种时，并不必然产生免疫促进作用，不同的细胞因子经常产生不同的效果，甚至有负面效应产生。此外，抗肿瘤调节剂Ubenindx（UBX）以及阳离子脂质体免疫刺激剂单磷酸脂（MPL）乃至一些多肽，包括乙肝表面抗原等，也都曾作为佐剂用于核酸疫苗，并取得了较好的效果。

　　2．7 试验动物年龄和品系许多研究表明，幼龄动物接种DNA时，在体内表达水平较高，并产生较好的免疫应答。而且，核酸疫苗不受母源抗体的抑制，在新生动物的感染防治上具有良好的应用前景。随着动物基因型的不同，免疫应答的强度也有所不同，试验证明，BALB／C品系小鼠和C57BI／6品系小鼠在同样条件下进行核酸疫苗接种，却呈现不同的免疫反应。

　　已有报道核酸疫苗对狂犬病、肝炎、布氏杆菌病、传染性支气管炎、轮状病毒感染、牛疮疹病毒感染、猪瘟、结核病、鼠疫杆菌等感染有预防作用。

　　3 存在问题及展望

　　基因免疫技术的产生极大地丰富了免疫学的内容，解决了目前在制剂中存在的诸多问题，展示了其强大的优越性，但在实际应用中，它仍不会完全代替目前使用的传统疫苗免疫，主要是由于人们对其安全性存在顾虑。主要有以下几点：1）核酸疫苗能长期在体内表达，是否会引起机体的过度免疫或产生免疫耐受现象，最终导致机体的免疫抑制。2）外源基因进入机体会不会与宿主的基因发生整合，导致宿主细胞肿瘤基因发生活化，进入宿主细胞的DNA最终会向如何。3）持续的抗原表达激起的强的CTL应答，可能对机体其他细胞产生毒性杀伤作用。4）DNA接种后，会不会引起机体的免疫功能发生紊乱，产生抗DNA抗体。5）目前进行的试验都是以动物为模型，应用于人体后是否会出现不良反应。以上这些都是今后需要重点研究解决的问题。

　　总之，核酸疫苗作为一种新型疫苗已得到人们的肯定，其应用前景木可估量。大量试验结果表明，核酸疫苗可作为病毒、细菌或寄生虫的预防疫苗，又为非感染性疾病的治疗提供了新的希望。相信，随着分子生物技术的不断发展以及人们研究的不断深入，核酸疫苗必将会为改善人类和动物的健康作出大的贡献。