肿瘤耐药发生的原因以及耐药基因的研究

1 概述

     影响化疗效果的一个重要问题是发生了对细胞毒药物的耐药性。耐药性的产生机制，尤其是多药耐药性问题是目前研究的一个重点。

根据肿瘤细胞的耐药特点,耐药可分为原药耐药(PDR)和多药耐药（MDR）两大类，原药耐药(PDR)是指对一种抗肿瘤药物产生抗药性后，对非同类型药物仍敏感；多药耐药性（multiple drug resistance，MDR）是指一些癌细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性，同时对其他非同类药物也产生抗药性，是造成肿瘤化学药物治疗（化疗）失败的主要原因。 

     多药耐药可进一步分为内在性多药耐药(intrinsicMDR，也有译成天然性多药耐药)和获得性多药耐药(acquired MDR)。内在性多药耐药(intrinsicMDR)的肿瘤,一开始对抗肿瘤药物就具有抗药性。包括消化器官、呼吸系统、泌尿系统以及中枢神经系统肿瘤引起的约占61％；属获得性多药耐药(acquired MDR)的肿瘤,包括皮肤癌、乳腺癌、生殖器癌、内分泌肿瘤、白血病和淋巴瘤,约占33％。

     许多天然来源的抗肿瘤药物如生物碱类抗癌药物(秋水仙碱、长春碱、三尖杉酯碱和酯杉醇等),蒽环类抗癌抗生素(阿霉素和柔红霉素),表鬼臼毒素类(Vp-16和VM-26)及合成药(米托蒽醌和胺苯丫啶)都极易发生MDR。新发现的药物如紫杉醇和治疗慢性粒性白血病的STI-571,都是刚用于临床就发现有耐药性,这使问题更加严重。

     2 耐药发生的机制 

     2.1 DNA修复能力的增强与耐药的关系 

     DNA是传统的化疗药品烷化剂和铂类化合物的作用靶点，这些药物的细胞毒性与DNA损伤有关。DNA损伤的一个修复机制是切除修复，切除修复需核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等的参与。化疗药致使DNA损伤，当二氢叶酸还原酶(DHFR)和DNA损伤修复相关酶活性增强（MGMT）可增加其对化疗药的耐药程度。

     阿非迪霉素（aphidicolin）是DNA多聚酶α和γ亚基的抑制剂

     2.2 P-糖蛋白与多药耐药

     目前研究最多的是多药耐药，与多药耐药有关的分子是P-糖蛋白。1976年，Juliano等首先在耐药有中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中发现一种分子量约为1.7×105的膜糖蛋白，在敏感细胞中却不存在。以后，研究者陆续在不同来源的多药耐药细胞中发现这种糖蛋白，其分子量在1.3×105~1.8×105之间，主要集中在1.5×105~1.8×105之间。并发现该糖蛋的表达和细胞膜的通透性、细胞内药物浓度以及细胞耐药程度有关。定位于7号染色体的q21.1带上的MDR1基因。完整的P-gp分子共有12个跨膜疏水区和2个ATP结合位点，在膜内以二聚体或四聚体方式存在。P糖蛋白是一种能量依赖性药物排出泵，也就是说它可以与一些抗肿瘤药物结合，也有ATP结合位点。P-糖蛋白一旦与抗肿瘤药物结合，通过ATP提供能量，就可将药物从细胞内泵出细胞外，使药物在细胞内浓度不断下降，并使其细胞毒作用减弱直至散失，出现耐药现象。P-gp在正常胆管、肾、小肠、肾上腺、造血干细胞等均有表达，负责激素运输及排泌毒物等生理功能。P-gp高表达的肿瘤病人常伴预后不良，如低缓解率、高复发率、生存期短，可作为预后评价指标。

     钙拮抗剂（或钙调蛋白拮抗剂）如维拉帕米、异博定、尼卡地平可使耐药细胞部分恢复对化疗药物的敏感性，其中以维拉帕米的作用最明显。维拉帕米对耐药细胞的作用不是通过调节钙浓度，而是与抗癌药物竞争P-糖蛋白的结合位点。但是钙拮抗剂在逆转耐药的剂量下还具有一些副作用，使这类药物临床应用受到限制。

     钙调蛋白（CAM）抑制剂：改变膜电位，使耐药细胞膜电位恢复至敏感细胞水平，从而恢复其敏感性。如钙调蛋白拮抗剂三氟拉嗪的作用。

     亲脂性化合物：环孢菌素类（环孢菌素A及其衍生物SDZPSC833）。

     激素及抗激素类化合物：（TAM）及抗孕激素药RU486 ，孕酮、甲地孕酮。

     2.3 谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）与肿瘤耐药性

     GSTs是一种广泛分布的二聚酶，它可以单独或与谷胱甘肽一起参与许多环境毒素的代谢、解毒。根据其在细胞内定位的不同，一般可分为α、μ、π、θ及膜结合微粒体5种类型 。GST-π又称酸性同工酶，是从胎盘中分离出来的一种酸性GST，其基因定位于11号染色体的q13位置。有7个外显子和6个内含子，全长3kb。它与恶性肿瘤关系最密切，约占其总数的90％，主要分布于消化道、泌尿系统和呼吸道上皮。GSH是一种含半胱氨酸的三肽，为细胞内主要的非蛋白巯基。GSTs能够催化机体内亲电性化合物与GSH结合，使有毒化合物增加水溶性、减少毒性，最终排出细胞外。这种结合还可防止有毒化合物与细胞的大分子物质（如DNA、RNA和蛋白质）结合。正常情况下可作为一种保护机制使细胞免受损害，而肿瘤细胞可以通过调节GSH水平、增加GST活性等加速化学药物的代谢。

     针对谷胱甘肽和GST的逆转剂：目前抑制GSH的药物有丁硫氨酸亚砜胺（buthionine sulfoximine ,BSO）、硝基咪唑类、VitK3、扑热息痛、硒酸钠、硒半胱氨酸、GS-EA等。BSO是一种人工合成的氨基酸，它是GSH合成限速酶－γ谷氨酰-半胱氨酸合成酶的强效抑制剂，能有效地阻断GSH的合成，从而降低细胞内GSH水平，并增加肿瘤细胞对Mit、DDP和MMC的敏感性。利尿酸，其可逆转烷化剂的耐药，且有实验证实与BSO联用时逆转作用更大。此外，还有依他尼酸(ethacrynic acid)等。

     2.4 拓扑异构酶Ⅱ

     拓扑异构酶是DNA复制时必需的酶，它在染色体解旋时催化DNA断裂和重新连接，拓扑异构酶是许多DNA插入和非插入药物作用的靶点，拓扑异构酶Ⅱ在数量和功能上的改变可能是产生细胞耐药的机制。

     2.5 蛋白激酶C(PKC)

     PKC是一组Ca2+/磷脂依赖的同工酶，由两个不同的功能部位组成，即与磷脂、甘油二酯结合的疏水性调节部位，以及含有ATP的底物蛋白结合区域，后者是亲水性催化部位。PKC有12种类型，各亚型具有不同的组织表达和特定的细胞定位，其中，PKCα和PKCθ与肿瘤多药耐药的关系最为密切。PKC在机体细胞增值、分化和凋亡信号传导调控方面发挥重要作用，同时在肿瘤发生、发展及对抗瘤因子的反应方面也扮演着重要角色。PKC参与蛋白质的磷酸化过程，而p-gp是一种磷酸化蛋白，MDR细胞中PKC活性增高，说明两者存在一定的联系。

     根据作用于PKC的部位，其抑制剂可分为3类：①作用于催化区；②作用于调节区；③对以上两区均有作用。目前已证实的逆转剂有Staurosporine及其衍生物NA-382、CGP41251;此外还有K-252a、calphostinC、H-7等药物。

     2.6 多药耐药相关蛋白MRP

     MRP属ABC转运蛋白超家族成员，MRP基因定位于16号染色体p13.1带上，由6500bp组成，编码1531个氨基酸的跨膜糖蛋白，分子量为190kD。耐药的发生与依赖ATP的谷胱甘肽S结合载体（glutathione-S-conjugate carrier）活性提高的缘故，谷胱甘肽S结合的输出载体又称为"GS-X泵"，它可将阴离子的共轭物排泄出细胞，并在清除外源性毒素中发挥作用。MRP能介导药物中的谷胱甘肽硫共轭物、葡萄糖醛酸甙共轭物和硫酸盐共轭物排出细胞。MRP转运的步骤可能为：GSH合成→GSH与药物偶和→MRP将药物泵出细胞外。MRP不但定位于血浆细胞膜，而且存在于内质网、高尔基滤泡处，提示MRP还可在细胞内隔离药物，使药物不能与靶位点结合，从而间接导致耐药。

     喹啉类、抗激素类（如抗孕激素RU486）、非甾体抗炎药（NASID）、SN-38、GST耗竭剂都能逆转MRP介导的MDR。

    2.7 肺耐药蛋白（LRP）

     是1993年由Scheper等在1株无p-gp表达的对多种药物耐药的非小细胞肺癌细胞系SW-1573中最先发现的与多药耐药有关的蛋白称LRP。LRP基因定位于16号染色体，LRP的cDNA全长2688bp,编码896个氨基酸，分子量为110kD，主要位于胞浆，呈粗颗粒状或囊泡状。MVP可通过两种途径引起MDR:一是封锁核孔,使药物不能进入细胞核,二是使进入细胞内的药物转运至胞质中的运输囊泡,呈房室分布,最终经胞吐机制排出。

     2.8 乳腺癌耐药蛋白（BCRP）

     BCRP定位于染色体4q22，含有一个开放读框（ORF），编码一个633氨基酸的蛋白，至少与50个ATP结合盒(adenosine triphosphate -binding cassette,ABC)膜转运蛋白具有同源性。BCRP结构的最主要特点是只有一个ATP结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域,这与典型的ABC转运蛋白明显不同,后者往往由两个同源部分组成,每个部分含有一个ATP结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域。因此,称BCRP为半转运蛋白,推测可能本身或与其它转运分子形成二聚体或多聚体而发挥作用。

     2.9 细胞凋亡与耐药

     p53、bcl-2和c-myc发生缺失、突变等导致表达异常（突变型）时，对凋亡过程调控异常，可抑制化疗药物诱导的凋亡，导致耐药，同时也可特异性激活MRP-1／P-gp，产生MDR。c-myc基因很可能参与了mdr1基因的调控。半胱氨酸蛋白水解酶和耐药：天门冬氨酸半胱氨酸特异性蛋白酶家族即caspase家族，亦称ICE/CED-3家族，是一组与细胞凋亡有关的蛋白酶，也参与MDR。Topo I和Topo II可作为caspase 3和6作用底物。化疗药物引起细胞凋亡均须激活caspase。

     加入促凋亡物质如全反式维甲酸等可降低耐药细胞BCL-2、BCL-XL等基因的表达。植入促凋亡基因，如野生型p-53基因等。

     2.10 其它

     细胞膜的改变影响药物的转运和外排；细胞激素受体量和亲和力的改变；一些细胞因子(如IL-6 )等也与肿瘤细胞耐药的发生相关。

     3 利用生物技术逆转耐药

     3.1 给药载体介导系统在耐药逆转中的应用 

     逆转剂的应用无疑是解决MDR的一种常用方法，但往往因为逆转剂的毒性较强，副作用较大而影响其在临床上的广泛引用。因此，借助某些给药介导载体，减少药物用量，实现药物的靶向给药将是颇有意义的新途径。包括：①多肽、蛋白类介导载体；②脂质体（liposome）介导；③豪微粒(nanoparticles,NP)介导。

     3.2 反义寡核苷酸技术（ASONs）

     就是用一段人工合成的能与RNA或DNA互补结合的寡核苷酸链来抑制基因的表达，其作用原理是：①ASONs与DNA结合，抑制DNA复制和转录；②ASONs与mRNA前体结合，阻断RNA加工、成熟，影响核糖体沿mRNA移动；③激活RNase剪切杂交链中未配对的碱基。最近有学者用MRP和bcl-2反义寡核苷酸共转染耐顺铂肺腺癌细胞株（A549／DDP），使该细胞对顺铂敏感性增加4.8－7.2倍。同时对VP-16和表阿霉素敏感性也同步增加。杂合子丢失（Loss of heterozygosity，LOH）可引起必需基因的单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms,SNPs）,抑瘤基因P53附近的核糖核酸聚合酶II（POLR2A）基因经常在肿瘤细胞显示杂合性丢失。Kees Fluiter等的报道显示，直接作用于POLR2A的反义寡核苷酸能抑制体内肿瘤细胞生长，并且一个碱基的错配就能有效地抑制肿瘤生长的特定等位基因。

    3.3 反义RNA技术

     反义RNA技术指利用基因重组技术，构建人工表达载体，使其体外或体内表达反义RNA，从而抑制靶基因的表达。其作用原理有：①与前mRNA结合，影响mRNA的成熟和在胞浆内转运；②与相应的靶RNA结合从而激活RNase,加速靶RNA的降解；③直接与起始密码子AUG结合而阻止转录的启动；④互补作用于SD编码区的反义RNA可阻止核糖体在mRNA上的移动。Gao等分别把携有MDR1、MRP反义RNA的逆转录病毒导入阿霉素选择出的人NSCLC细胞株GAOK，细胞对阿霉素、长春花碱、秋水仙碱的耐药程度减少40％-50%，而共转染MDR1和MRP反义RNA后发现，p-gp、MRP的表达分别减少64％和93％，对上述化疗耐药程度减少97％左右。实验提示p-gp、MRP在GAOK细胞株耐药过程中共同起作用，共转染两者的反义RNA可协同逆转耐药。

     3.4 核酶技术

     核酶是一类具有酶活性的RNA分子，由Cech等首次发现，它能特异性地识别mRNA中的GUC序列，并催化RNA的剪接和剪切反应，这种作用无需能量就能使RNA被降解，使之无法进行转录和翻译，而且催化效率很高，一分子核酶可切割多分子的靶RNA，自身不被消耗可重复使用。核酶的基因组成分两部分：中间的极为保守的核苷酸序列（活性中心）和两端的引导序列。引导序列与靶RNA互补结合时，中间保守序列即在该特定位点切断，从而具有高度特异性。另外，核酶不编码蛋白质，无免疫原性。由于其高效率、高特异性、少副作用的特点，核酶在基因治疗中倍受青睐，被誉为"分子剪刀"和"分子外科"，在抗HIV、抗病毒和治疗白血病及肿瘤方面得到了广泛的应用。Chen等用mdr1核酶导入A549／R对mdr1 mRNA进行剪切，观察到mdr1 mRNA减少，p-gp表达下降，细胞对阿霉素敏感性增加200倍。GAO 等用逆转录病毒介导的MDR1核酶来抑制p-gp在耐药的肿瘤细胞系GAOK／DOX的表达。Kobayashi用MDR1核酶来逆转急性淋巴细胞白血病细胞的耐药性，结果药物敏感性增加了700倍。值得指出的是，逆转录病毒由于其可产生高效价病毒，具有高感染效率，可感染许多种细胞，且对宿主细胞无害而在基因逆转方面具有潜在优势。目前，反义核酸药物的开发也是最有前景的项目之一，但事实上仍有许多问题待解决：①寡聚物易被降解（经过化学修饰的类似物也可在体内缓慢清除）；②细胞摄取的效率有待提高；③寡聚物的非特异结合降低了其效率；④对mRNA的非特异阻断（可能由于寡聚物同DNA序列能形成部分或暂时的碱基配对）。

     3.6 细胞因子基因

     Stein等研究发现一些细胞因子如TNF、IFN和IL-2可降低MDR1基因mRNA和p-gp的表达水平，增加细胞对药物的敏感性。但细胞因子静脉应用副作用极大，因此他们将细胞因子基因转入肿瘤细胞，结果显示可明显降低MDR1 mRNA 和p-gp的表达水平，使细胞内药物浓度提高。AKI等在研究肝细胞癌细胞系（HepG2,HuH7，SK-Hep-1）时发现,IFN-α和顺铂（CDDP）联用时，可降低MDR1、MRP、TOPO IIα和TOPO IIβ基因在HepG2中的表达；降低MDR1和GST-π基因在SK-Hep-1中的表达,从而可增加耐药细胞系对顺铂（CDDP）的敏感性。这提示我们，联合应用CDDP和IFN-α来治疗进展期肝癌可能具有一定的临床价值。

     3.7 间接对抗MDR的基因治疗

     将一些耐药基因（如MDR1、MRP等）转移至造血干细胞，以降低化疗药物对骨髓的毒性，这样就可能用高剂量的药物杀伤肿瘤细胞而不破坏骨髓细胞，间接解决耐药的问题。体外实验表明,将MDR1基因转移至小鼠的正常骨髓细胞,可提高化疗剂量而不增加骨髓毒性.根据前临床研究结果，荷兰学者提出将MDR1基因转移至大计量化疗后无法治愈的肿瘤患者的造血干细胞开展临床I期的研究。通过临床I期研究主要想解决几个问题：①MDR1基因转移至骨髓造血细胞后是否可使CD34＋细胞MDR表达增加；②回输转染MDR1的细胞后是否可使造血重建；③是否具有长期重建造血的功能；④对于化疗引起的骨髓抑制是否具有保护作用。如果I期临床试验能获得令人满意的结果，这个方案将进入II期试验，即加大化疗计量，观察对骨髓的保护效应。除MDR基因外，二氢叶酸还原酶（mDHFR）、MGMT、GST及醛脱氢酶（ALDH）等也被用于肿瘤耐药基因的研究。