偶看新闻手机屏幕白斑怎么消除:【求助】为什么连接总是连不上？
来源：百度文库 编辑：偶看新闻 时间：2024/04/28 07:06:10
连接酶及所用的缓冲液
a、所用的连接酶活性不好；
b、连接酶需要ATP的存在，而ATP在常温或高温条件下容易分解破坏，所有Buffer应该尽量新鲜。如果您的缓冲液时间太长，建议您可以换一支新的Buffer试一下。
2、感受态细胞
感受态细胞反复冻融或者时间太长，转化效率降低。可以重新制作一批感受态细胞。
3、DNA。
a、酶切。这一步还是很重要的。有的内切酶纯度不高，其中有一些核酸内、外切酶的污染，这样就会在酶切过程中在切割产生的末端上又切掉几个碱基，而如果有这种情况，电泳又根本检测不出来，所以再进行连接时，就始终连接不上。
b、纯化。应保证纯化的DNA的质量，如不含盐、EDTA等的污染。因为连接酶连接时需要Mg离子，如果混有EDTA的话，就会抑制反应。
c、用量。连接时DNA的用量不要太高，建议体系中总的DNA浓度为1-10ug/ml。
4、连接反应体系
不建议用太大的体系，一般10-20ul即可
a、所用的连接酶活性不好；
b、连接酶需要ATP的存在，而ATP在常温或高温条件下容易分解破坏，所有Buffer应该尽量新鲜。如果您的缓冲液时间太长，建议您可以换一支新的Buffer试一下。
2、感受态细胞
感受态细胞反复冻融或者时间太长，转化效率降低。可以重新制作一批感受态细胞。
3、DNA。
a、酶切。这一步还是很重要的。有的内切酶纯度不高，其中有一些核酸内、外切酶的污染，这样就会在酶切过程中在切割产生的末端上又切掉几个碱基，而如果有这种情况，电泳又根本检测不出来，所以再进行连接时，就始终连接不上。
b、纯化。应保证纯化的DNA的质量，如不含盐、EDTA等的污染。因为连接酶连接时需要Mg离子，如果混有EDTA的话，就会抑制反应。
c、用量。连接时DNA的用量不要太高，建议体系中总的DNA浓度为1-10ug/ml。
4、连接反应体系
不建议用太大的体系，一般10-20ul即可
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