银丝绕by千里瀛微盘:薄层色谱

薄层色谱，或称薄层层析（Thin-Layer Chromatography），是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术，是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。
　　薄层色谱法是一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品，因此又可用来精制样品。因此，薄层色谱法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
　　在我国新推出的2010版药典中，降低了薄层色谱分析所占的比例，这似乎表明着薄层色谱分析方法将会逐渐被替代，但是在实际的工作中，薄层色谱法以其快速、简便的优势一直活跃在分析检测的一线，加上电动点样机和薄层扫描仪的出现，加快了点样和检测的速度和质量，使得这一技术在生产分析中起到了重要作用。

　　一、薄层色谱的分类
　　1、常规薄层色谱
　　TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。常规薄层色谱的固定相为未改性的硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素和聚酰胺等，平均颗粒度20μm，点样量1~5μL，展开时间30~200min，检测限1~5ng。以正相色谱占主导地位，设备简单，所需资金投入少；不足之处是分离所需时间长，有明显的扩散效应。

　　2　高效薄层色谱
　　高效薄层色谱（HPTLC）采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性。C2、C8和C18化学键合硅胶板为常见反相薄层板。高效板厚平均100~250μm、点样量0. 1~0. 2μL，展距3~6cm，展开时间3~20min，最小检测量0. 1~0. 5μg，较常规TLC可改善分离度，提高灵敏度和34重现性，适用于定量测定。
　　（1）棒状薄层色谱
　　棒状薄层色谱(TLC-FID)是用石英棒作支持物涂上硅胶，点样、溶剂展开。样品在色谱棒上分离后，将棒通过适当的机械传动装置穿过氢火焰离子化检测器火焰中心，使化合物燃烧裂解，形成离子碎片和自由电子，再由电极收集并产生与化合物量成正比的电流信号，从而测出各物质的含量(图1)。该方法优点是灵敏度高，操作简便，薄层棒可反复使用，通用性好，可用于非挥发性、没有可见及紫外吸收、没有荧光以及衍生化困难的有机化合物的定性定量分析，被广泛地应用于工业、食品、药物及医学等领域。

图1　棒状薄层氢焰扫描仪示意图

　　（2）加压薄层色谱
　　加压薄层色谱(OPLC)是指在水平的薄层色谱板上施加一弹性气垫。展开剂不是靠毛细作用力，而是靠泵压被强制流动，因此可以采用更细颗粒的吸附剂和更长的色谱板，分离所需时间缩短，扩散效应减小，分离效果更好。仪器专场展示：薄层色谱仪  色谱配件  薄层色谱配件关 键 词：薄层色谱 发展趋势 未来 收藏分享评分〓疯子哥〓

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沙发  只看作者  回复于：2010-7-20 10:57:59 回复本贴 回复主题 编辑 举报 管理 （3）离心薄层色谱
　　离心薄层色谱(CTLC)又叫旋转薄层色谱，是一种离心型连续洗脱的环形薄层色谱分离技术，主要是在经典的薄层色谱基础上运用离心力促使流动相加速流动。离心力用于分离，可以减少破坏，对沸点高、分子量大的化合物有利，可用于分离100mg左右的样品。使用商品化生产的离心薄层色谱仪，仪器结构简单。尽管其分辨率低于制备型HPLC，但操作简便，分离时间短，并且无须将吸附剂刮下即可将产物洗脱下来，广泛应用于合成和天然产物的制备分离。

　　（4）胶束薄层色谱
　　A m strong在1979年首次研究了胶束薄层色谱(miceller thin layer chromatography，M-TLC)。胶束薄层色谱分正相胶束薄层色谱和反相胶束薄层色谱两种。正相胶束薄层色谱是在聚酰胺、氧化铝或硅胶薄层上用低浓度表面活性剂的水溶液为展开剂；反相胶束薄层色谱是在硅烷化的硅胶薄层上用低浓度含少量水的非极性有机溶剂为展开剂。胶束薄层色谱能使一些结构相似、难溶于水的化合物得到较好分离。微乳液与胶束同属于低粘度的缔合胶体，同样存在表面活性。与胶束相比，微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水等在一定配比下自发形成的无色透明、低粘度的热力学稳定体系，具有更大的增溶量和超低界面张力。微乳液作为展开剂，对待测成分具有独特的选择性和富集作用，更有利于提高色谱效率，可同时分离亲水物质、疏水物质、带电成分、非带电成分等。胶束薄层和微乳液薄层主要用于三次采油、痕量金属离子的回收和生物碱分析。胶束薄层色谱的最大优点是很少使用有毒、易挥发、易燃、易造成污染的有机溶剂，并且使用方便、操作简单和经济廉价。

　　（5）包合薄层色谱(ICC)
　　1983年，Fujimura等首次把环糊精键合到硅胶表面，制成键合固定相，并用于薄层色谱，以后关于环糊精固定相的合成、改性、应用有了不少报导。β-环糊精(β-CD)是由7个葡萄糖分子通过α-1， 4糖苷键连接而成的环状低聚糖。由于其特殊的结构，能够在它的疏水空腔中选择性地包结各种客体分子，形成具有不同稳定性的包结配合物，从而达到分离效果。β-环糊精还可作为薄层色谱的展开剂和增敏剂。这种包合薄层避免了使用有毒、易挥发、易燃的有机溶剂，具有较高的选择性，适用于分离普通化合物，同分异构体及光学异构体。

　　（6）二维薄层色谱
　　二维薄层(2D TLC)是分离多组分复杂混合物的一种有效方法，基于在薄层板两个垂直的方向上进行相同或不同机理的展开。将样品点在薄层板的一个角上，展开至适当距离后取出，挥干溶剂，再将板以与原展开方向成90°的方向展开，第一次展开被分离的组分组斑点，成为第二次展开的原点。二维薄层的优点在于可以用不同的流动相二次展开，并且在二次展开前，可以用其他方式处理薄层和已实现组分离的样品。例如二维薄层SRS(分离-反应-分离)技术，就是在第一次展开后，进行板上反应，再进行二次展开分离。在二次展开前，还可以点加标准样。周漩等用二维薄层色谱分离人参皂苷，点样后，将薄层板先沿Y轴方向以不同比例的氯仿-甲醇为流动相进行展开，展开后吹干，将板置于密闭容器中抽真空以除去残留在板上的展开剂，然后沿X轴方向以不同比例的正丁醇-乙酸乙酯为流动相进行二维展开，结果比一维展开分离出了更多新的皂苷组分。Pyka在硅胶60F254铝板上分别用正己烷-乙酸乙酯-乙酸和氯仿-正丁醇-乙酸-水二维展开分离了7种胆汁酸。 〓疯子哥〓

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板凳  只看作者  回复于：2010-7-20 10:58:29 回复本贴 回复主题 编辑 举报 管理 二、薄层色谱检测方法
　　薄层色谱的定量检测有吸收测定法、荧光测定法和荧光猝灭法。对在可见及紫外光区有吸收的化合物可用钨灯和氘灯在200~800nm范围进行透射和反射吸收法测定。化合物本身或者经过色谱前和色谱后衍生化生成对紫外有吸收并能放出更长波长的化合物适用荧光法测量，荧光法灵敏度高，最低可测至pg级。本身无颜色、又无特征紫外吸收或荧光，并且不易衍生的化合物可采用荧光猝灭法测量，使用含有荧光剂的薄层板。薄层色谱扫描仪的常见扫描方式有直线扫描、锯齿扫描、飞点扫描、圆形扫描、倾斜扫描和多通道自动扫描等，分别采用单波长或双波长的测光形式。除此之外，薄层色谱还可与其他分离分析技术联用，更有利于化合物的定性鉴别和定量检测。
　　（1）薄层色谱-傅立叶变换红外光谱联用检测
　　化合物的红外光谱能提供丰富的结构信息，是定性的有力手段，也可以用于定量。目前薄层色谱和红外技术联用主要采用原位法、光声光谱检测法(PAS)、自动洗脱物转移法和红外显微镜法。原位法是采用改装的DRIFTS附件，由步进马达驱动TLC板，对色谱斑点进行红外测量。由于TLC固定相有强红外吸收，分析物吸收带容易发生畸变。光声光谱法是将TLC板上附着有分析物的固定相依次转移到PAS附件中进行FTIR-PAS分析，再用差谱方法扣除固定相的吸收，得到分析物光谱图。同原位一样，固定相的强红外吸收会对分析物光谱产生干扰。自动洗脱转移法使用TLC-FTIR自动接口。样品在常规板上展开后，将板旋转90°，用螺丝固定在带有样品杯的金属部件上，杯中充有KBr或KCl粉末，杯底部的金属丝芯和TLC板接触，将板置于转移附件里，展开的各组分会被转移附件罐里的溶剂推向顶部，借助金属丝芯的毛细作用进入杯中。转移完，用干燥空气流吹洗各样品杯表面，使杯中溶剂挥发，组分沉积在杯顶部的KBr表面上，最后进行红外扫描。红外显微镜法是用氧化钴作固定相涂在显微镜载片上，样品在氧化钴上展开后直接用红外显微镜测量，用氧化钴代替硅胶和氧化铝，可消除固定相的干扰。

　　（2）薄层色谱-拉曼光谱联用检测
　　拉曼光谱和红外光谱都属分子振动光谱，前者为散射光谱，后者为吸收光谱，分子偶极矩越大，红外吸收强度越大；振动时分子极化率改变越大，拉曼散射越强，所以通过两种光谱的相互配合、补充，可以更好地解决化合物结构测定问题。
　　薄层色谱和表面增强拉曼光谱(SERS)联用较多。表面增强拉曼要求检测的分子必须含有芳环、杂环、氮原子、硝基、氨基、羧酸基以及磷、硫原子，因为这些基团可通过孤电子对或π电子与表面增强基底相互作用，从而产生拉曼散射增强效应，样品用量可低至数微克。常用表面增强基底为银溶胶，通过硝酸银、柠檬酸三钠经氧化-还原反应制备，该银胶具有很强的表面增强活性，滴洒在薄层斑点原位，水分挥发干后测FT-SERS谱。

　　（3）薄层色谱-质谱联用检测
　　相比其他联用技术，质谱是一种灵敏度高、选择性好、可提供丰富的组成和结构信息、能够进行有效定性的现代分析手段。薄层色谱与质谱的联用，实现了优势互补，更利于复杂样品的定性。由于分离后的薄层色谱体系包括过量吸附剂、粘和剂、荧光指示剂，残余溶剂和盐等，每一个斑点都很难达到完全纯净，因而对质谱的接口提出了更高的要求。目前常见的接口技术有以下几种:①提纯直接引入法。提纯直接引入法是实现TLC-MS联用的最简单方法，也是广泛采用的方法。在这种方法中，TLC和MS的联用是离线的，薄层色谱仅作为一种分离提纯方式。样品经薄层色谱分离后，斑点从板上转移，用适当的溶剂洗脱，蒸去溶剂后精制得纯品，再将纯品注入质谱计进行分析。②热蒸发法。该方法适用于易挥发、热稳定、分子量小的样品，样品分子受热蒸发，从而直接同吸附剂分离。③特殊洗脱技术。特殊洗脱技术包括许多设计巧妙的仪器装置和方法，使溶剂能有效将样品洗脱并迅速转移至质谱计，连续性好。④毛细管技术。毛细管可以广泛用于TLC-MS接口上。利用高温高压迫使溶剂从薄层板转移至坯中渗滤，从而使样品快速流过毛细管，直接进入快原子轰击电离(FAB)室或其他电离室，这与加压薄层色谱原理相似，但不需要泵，设备小巧易制，连续性好。
　　其次，实现TLC与MS联用，还要考虑质谱中样品分子的电离方法。传统的电子轰击源(EI)和化学电离源(CI)均可应用于TLC-MS。还有一些新的分子离子化方法，如快原子轰击(FAB)、二次离子质谱(SIMS)和基质辅助激光解吸(MALD)等。这些新的离子源的使用，使TLC-MS在化合物定性方面更加快速、准确、灵活，大大扩展了薄层色谱的应用。
　　除此之外，还发展有TLC-MS-MS技术。串联质谱可提供比单一质谱更详细的信息，且不受背景离子的干扰，不受共色谱体系污染。将串联质谱同薄层色谱联用，同TLC-MS联用一样，可采用"手动方式"或"仪器方式"连接。此技术广泛应用于合成化合物和天然产物。

　　（4）薄层色谱-核磁共振联用检测
　　核磁共振与红外光谱、质谱比较，灵敏度相对较低，但核磁共振能提供的原子水平上的结构信息，这是其他方法无法比拟的。薄层色谱-核磁共振的方法是将样品用薄层色谱展开后，刮下样品薄层斑点，再用氘代试剂将样品洗脱下来，进行核磁共振检测。受核磁共振灵敏度所限，这种分析需样量较大。

　　（5）薄层色谱-电化学方法联用检测
　　薄层色谱与各种电化学方法联用操作简单，将薄层色谱分离出的样品斑点刮下，直接加入电化学反应溶液中即可获得电化学检测与分析结果。

　　（6）其他联用检测
　　薄层色谱可以与高效液相色谱（HPLC）联用，一些样品组成复杂或含量极微时，直接采用高效液相色谱分析比较困难，可用薄层色谱先分离、纯化，将样品在薄层的斑点洗脱下来，再将洗脱液进样于高效液相色谱分析。薄层色谱-气相色谱联用，将样品先在薄层上分离，定量收集欲测组分的斑点，经洗脱、浓缩、衍生化等步骤，注入气相色谱仪再进行分离和鉴定。除此之外，薄层色谱还可与原子吸收光谱、荧光光谱和光声光谱等联用。 [2010-7-20 10:59:33 Last edit by madprodigy] 〓疯子哥〓

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3#  只看作者  回复于：2010-7-20 10:58:48 回复本贴 回复主题 编辑 举报 管理 三、薄层色谱的应用
　　薄层色谱法具有操作简单、快速，设备投资小、检测运行成本低等特点，在医药、生物、环境、食品等各领域得到了广泛的应用。
　　1、应用领域
　　（1）医药方面的应用
　　由于薄层色谱的快速、简便与实效性，广泛应用于中草药品种鉴别和成分分析、中成药鉴别和质量标准研究、合成药物的定性鉴别、纯度检查、稳定性考察和药物代谢以及合成工艺监控分析、生化和抗生素研究等方面。
　　应用薄层扫描即薄层色谱与紫外分光光度或荧光光度分析联用，可进行各种药物的定量分析。

　　（2）生物样品与毒物分析
　　薄层色谱法分析的生物样品多为血清、血浆或尿液等,用来进行药物生物利用度的分析,检测临床用药的血药浓度,以利于诊断临床疾病等。毒物分析的内容比较广泛,包括植物毒素、真菌毒素、兴奋剂、药物中毒、走私毒品、农药以及尸检、刑侦破案等方面的样品分析。

　　（3）环境有害物质的分析
　　薄层色谱法在环境有害物质的应用及分析主要包括对农药及农药残留分析、有毒金属测定和多环芳烃测定等。

　　（4）食品分析
　　薄层色谱法在食品安全领域主要应用于分离测定食品中所含有的碳水化合物、维生素、有机酸、氨基酸等天然营养成分，也用于食品添加剂如色素、防腐剂等，以及某些真菌毒素如黄曲霉毒素的分析。

　　（5）其它领域的应用
　　薄层色谱法还适用于无机及金属有机化合物分析、染料及化妆品分析、石油和煤分析、手性化合物分离和化工及高分子材料分析。 [2010-7-20 10:59:46 Last edit by madprodigy] 〓疯子哥〓

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4#  只看作者  回复于：2010-7-20 10:59:15 回复本贴 回复主题 编辑 举报 管理 2、应用方法
　　（1）定性鉴别
　　化学上经典的定性鉴别，例如经典的有机定性分析或经典的毒物分析，是利用各种化合物的溶解度不同和所含功能基的不同，用溶剂提取或用试剂处理，把它们分组或分为单一组分，然后作试管反应或点滴反应（颜色反应），或根据它们衍生物的理化性质进行定性鉴别。这种方法的缺点是样品用量较大，分离手续麻烦，分析时间较长（几小时或几十个小时），并可能有杂质干扰，现采用合适的展开剂和显色剂在薄层上作为分离和鉴别，根据样品中组分的值和显色情况，同时用标准作对照，一般即能确证为某一化合物，用薄层色谱法定性，样品用量小，分离方便，分离时间短（几分钟或几十分钟），检出灵敏度高。例如，在毒物分析中检验是否巴比妥安眠药中毒时，取胃内容物或尿样品，先用盐酸酸化后，用乙醚提取，乙醚提取液脱水，过滤蒸干，溶于无水乙醇中，点在硅胶版上用氯仿无水乙醇（36：1）展开，用硫酸汞二苯偶碳酰肼试剂显色，并用标准品对照，依次见出巴比妥，苯巴比妥，戊巴比妥和异巴比妥。鉴别速度快（1小时），这对于抢救中毒患者和及时为医生提供治疗方案极为重要。

　　（2）药品的质量控制和杂质检查
　　药品的纯度，通常用熔点，吸光值等物理常数作为鉴定的指标。但是薄层检查也是药品质量控制和杂质检查的一种有效方法，有时甚至比一般方法更有效。一些国家的药典和药品规范已经采用。方法是把一定量的样品溶液（例如，相当于样品10%）点在薄层上，用展开剂展开并显色，同时用纯品作对照，如果样品不只显示出纯品位置一致的一个斑点，则表示含有杂质。进一步可用薄层作杂质的限量检查。在上例中，如果已经知道显色剂对杂质的最小检出量为0.1%，在薄层上点样后不显出杂质斑点，则杂质的量低于0.1%，或低于限度，也就是样品的纯度不低于99.9%。例如镏体药物的合成和精致工作中，常含结构类似的杂质，即按上述方法控制其质量和杂质的限量。

　　（3）化学反应进程的控制
　　反应副产物的检出以及中间体的分析，在化学反应进行到一定时间或反应终了时，把反应液取出作薄层分析，可以知道还剩下多少原料药未起作用。方法是把反应液或其有机溶剂提取液点在薄层上，同时点原料作参比对照，看薄层上是否出现原料药斑点。还可以用薄层检查反应副产物。如果化学反应分步进行，则每一步反应的中间体的质量和产率也都可用薄层进行定性和定量。例如在合成强力霉素的过程中，需要中间体甲烯土霉素氢化物为脱氧土霉素。氢化反应是否完全，可用薄层检查，如果反应完全，则反应釜中几乎没有或只有极少量的甲烯土霉素存在，薄层板上只显示出一个脱氧土霉素，如果薄层板上有上下二个明显的斑点，表示反应还没有完全，尚需继续还原，直到只显示出脱氧土霉素的一个斑点为止才能出料。

　　（4）柱色谱法分离条件的探索
　　柱色谱法的实验条件，例如选用什么吸附剂和洗脱剂较好，各个组分按什么顺序从柱中洗脱出来，每一分洗脱液中是含单一组分或就含几种没有分开的组分等，都可以在薄层上进行探索和检验。薄层上所有的展开剂虽不完全照搬柱色谱法上，但仍有参考价值。

　　四、薄层色谱的发展前景
　　薄层色谱法是中药分析中广泛应用的经典方法，随着薄层版、点样技术、展开技术方面的发展，薄层色谱的规范化，操作仪器化程度的提高，加之简单、便捷、经济灵敏、高效，必将在中药药物分析中发挥越来越大的作用。
　　薄层色谱因其设备简单、操作方便、适用性广，可以快速给出可靠、准确的结果等特点，一直被很多分析工作者所关注，并被用于许多领域。随着新的固定相和高速发展的仪器技术的引入，薄层色谱已成为一种灵敏、高效的分离与分析方法。今后，薄层色谱法仍将是可供选择的经济、可靠、快速的重要分析方法之一，并会有更加广阔的应用前景。