偶看新闻塑胶跑道效果图:维生素的测定
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17.2 维生素的测定
17.2.1 概述[2,3]
维生素广泛存在于各种生物体中，其种类繁多，化学结构与生理功能各异。因此无法按照结构或功能分类，按其溶解性可分为脂溶性(VA、VD、VE、VK)和水溶性(VB1、VB2、VB6、VB12 、VP、VPP 、VC)两大类。维生素是人体生命活动不可缺少的营养物质，它们一般在动物和人体内不能合成或合成数量少，满足不了动物和人体的需要，必须依靠从食物中摄取。在食物中缺乏了任何一种维生素，人和动物都会发生特有的缺乏症状，如缺乏维生素A、B和C 时，可分别引起夜盲症、脚气和坏血病等，严重时足以致命。某些维生素含量的高低，是评价农产品品质的重要指标之一。
维生素的分析是一项比较复杂的工作。其样品分析的一般程序是：①用酸、碱或酶分解样品，使其中的维生素游离出来；②用溶剂进行提取；③分离干扰物质，对样液进行分离提纯；④用适当的方法进行定量等。维生素的测定方法，有微生物学测定法、生物学测定法等。
仪器分析的方法有分光光度法、荧光分析法、薄层层析法、高效液相色谱法等。维生素的分析方法很多，选用方法时应根据样品的品种、类型、待测维生素的性质、含量以及干扰物质多少等因素来决定。下面重点介绍维生素C、维生素B 1和B2以及作为维生素A原的b-胡萝卜素的测定。
维生素C又称抗坏血酸，其纯品为白色无臭结晶，熔点为190~192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油剂，在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件下较稳定。还原型(L-抗坏血酸)可被氧化为氧化型(L-脱氢抗坏血酸)，还有一定的生理作用，如果进一步水解则生成2,3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。总抗坏血酸包括还原型、氧化型抗坏血酸和2,3-二酮古乐糖酸。
根据它具有的还原性质可以测定VC的含量。常用的测定方法有2,6-二氯靛酚法、2,4-二硝基苯肼法、铅-硫化氢法、碘酸法以及荧光分光光度法。2,6-二氯靛酚法用于测定还原型VC，其它方法多用于测定总VC的含量。
17.2.2 还原性维生素C的测定
17.2.2 .1 方法原理
抗坏血酸(VC)结构中有烯二醇结构存在 ，因此具有还原性，能将蓝色染料2,6-二氯靛酚还原为无色的化合物，VC则被氧化为脱氢VC，反应式如下：
还原型VC 氧化型2,6-二氯靛酚 脱氢VC 还原型2,6-二氯靛酚（无色）
2,6-二氯靛酚具有酸碱指示及氧化还原指示的两种特性，在碱性介质中呈深蓝色，而在酸性介质中呈浅红色(变色范围pH4~5)，其氧化态时呈深蓝色(碱介质中)或浅红色(酸性介质)，还原态时为无色。根据这个特性，用碱性蓝色染料的标准溶液滴定植物样品酸性浸出液中VC到刚变浅红色为终点，由染料的用量即可计算VC的含量。滴定终点的红色是刚过量的未被还原的(氧化型)染料溶液在酸性介质中的颜色。
通常测定VC浸提和测定都是在20g·L-1的草酸溶液中进行的，目的是保持反应时一定的酸度，避免VC在pH高时易被空气氧化(注1)。此染料不致氧化待测液中非VC的还原性物质，所以对VC的测定有一定的选择性。
本法适用于测定一般水果、蔬菜样品的还原型VC，不包括脱氢VC。如样品中含有Fe2+、Sn2+、Cu2+、SO32-、S2O32-、SO2等还原性杂质，则有干扰。
17.2.2 .2 主要仪器
高速组织捣碎机(8000~12000r·min-1)；电动离心机(4000r·min-1)； 半微量滴定管。
17.2.2 .3 试剂
1. 20g·L-1草酸溶液：称取草酸(化学纯)20g溶于水中，稀释至1L，贮于避光处(注2)
2. 60g·L-1 KI溶液。
3. 10g·L-1 淀粉指示剂。
4. 0.1000 mol·L-1 (1/6 KIO3)标准液：称取在105℃烘过2h的碘酸钾(KIO3 ，优级纯)1.784g溶于水，定容至500mL 。此为0.1000 mol·L-1 (1/6 KIO3)贮备液。使用时将此贮备液用煮沸并冷却的水稀释100倍，即成0. 0010 mol·L-1 (1/6KIO3)标准溶液。大约每星期应稀释配制一次。
5. VC标准溶液：称取维生素C(C5H8O5，分析纯) 20.0mg溶于20g·L-1草酸溶液，并用20g·L-1草酸稀释至100mL，此液约含VC 0.2mg·mL-1，置于冰箱中保存。临用前当天进行标定。
VC的标定：吸取VC液5.00mL于50mL三角瓶中，加入20g·L-1草酸溶液10mL，60 g·L-1KI溶液0.5mL，10 g·L-1淀粉溶液5滴，用0.1000 mol·L-1 (1/6 KIO3)标准液滴定至溶液突变为浅蓝色为止(约需滴定11mL)，计算VC的准确浓度：
VC溶液浓度，mg·mL-1= c V1×88/V2
式中 c —所用(1/6KIO3)标准溶液浓度(mol·L-1)；
V1—所用(1/6KIO3)标准溶液的体积(mL)；
V2—所用VC溶液的量(mL)；
88—维生素C(1/2 C5H8O5)的摩尔质量(注3) (g·mol-1)；
6. 2,6-二氯靛酚溶液：称取2,6-二氯靛酚(分析纯)50mg溶于约200mL含有NaHCO3(分析纯)52mg的温水中(< 40℃)，冷却后用水稀释至250mL。用玻璃滤器或折迭滤纸滤于棕色瓶中，保存在冰箱中。使用前，待溶液恢复至室温后，用VC标准溶液标定其准确浓度。在冰箱中保存时，每周标定一次(注4)。
标定方法：吸取已标定的VC标准溶液5.00mL(含VC约1mg)于50mL三角瓶中，加入20 g·L-1草酸溶液10mL，摇匀，用2,6-二氯靛酚溶液滴定至溶液呈浅红色，约在15s不褪色为止(应用染料溶液约10mL)。计算每毫升染料溶液相当于VC的mg数，即滴定度T(应约为0.1mg·mL-1 Vc)：
T= c×V1/V2
式中 c—所用Vc标准液的浓度(mg·mL-1)；
V1—所用Vc标准液的体积(mL)；
V2—所用染料溶液的体积(mL)。
17.2.2 .4 操作步骤
1. 样品处理：
(1) 新鲜果蔬样品：称取鲜样50.0~100.0g，放入组织捣碎机的杯中，加入等重量的20 g·L1草酸浸提剂，快速捣碎1min，将样品打成浆状。样品处理的整个过程应在10min中内完成，以免Vc被空气氧化。用小烧杯称取浆状物10~30.×g(含还原型Vc 1~5mg)，放入100mL容量瓶中，用20 g·L-1草酸溶液定容，若有泡沫可加2滴辛醇除去。过滤，若滤液色深，影响滴定终点的判定时，可加1~2勺白陶土脱色(注5)不易过滤，可用离心机分离。
(2) 多汁果蔬样品：可用纱布压汁后脱脂棉花快速过滤，量取10~20mL汁液，立即用20 g·l-1草酸溶液定容至100mL。
(3) 干样品：称取1~4.×××g(含还原型Vc 1~5mg)放入研钵中，加入20 g·L-1草酸溶液研磨成浆状液，洗入100mL容量瓶中，用2 0g·L-1草酸定容。
(4) 含有还原性物质的样品：含有较多Fe2+的样品可用80mL ·L-1醋酸代替20 g·L-1草酸作为浸提剂。亚硫化脱水样品，可于稀释至一定容量之前加入20mL丙酮，以除去SO2的干扰。
2. 样品的测定：吸取以上制得的无色滤液5.00~10.00mL(使含VC约0.2~1mg范围)放入50mL三角瓶中，用棕色半微量滴定管中装的2,6-二氯靛酚标准溶液滴定至浅红色，约在15s内不褪色为终点(注6)。同时以浸提剂做空白试验(空白值约0.08~0.10mL)。
17.2.2 .5 结果计算
还原型Vc含量 (mg·kg-1)=(V-V0)×1000×T / m
式中 V—滴定样品液所用染料溶液量(mL)；
V0—滴定空白所用去染料溶液量(mL)；
T—染料溶液的滴定度；
m—滴定时样品溶液中样品的质量(g)。
两次测定结果允许误差：
样品还原型Vc含量，mg·kg-1 允许误差，mg·kg-1
<100 5.0
100~1000 10.0
17.2.2 .6注释
注1. 偏磷酸是Vc的最佳稳定剂，且具有沉淀蛋白质的作用。但其价格较贵，在室温下放置易转化为正磷酸，降低对Vc的稳定性。草酸廉价易得，有与磷酸相近的稳定性。而醋酸适于浸提含有Fe2+的样品。
注2. 草酸不应置于日光下，以免产生过氧化物。当有催化剂(如Cu2+)存在时，过氧化物能破坏Vc。
注3. KIO3与还原Vc的主要反应如下：
IO3- + 5I- + 6H+ ===== 3I2 + 3H2O
I2 + C6H8O8 ===== C6H6O8 + 2I- + 2H+
从上述反应式可知1mol(1/6 KIO3)与1mol(1/2C6H8O8)完全反应，故1/2 C6H8O8的摩尔质量为88g·mol-1。
(注4) 2,6-二氯靛酚固体试剂有时含有分解产物，染料溶液长久贮存时也会生成分解主物，从而使滴定终点不敏锐，因此应在使用前检查。检查方法：取15mL染料溶液加入过量的Vc溶液，若还原后的溶液带有颜色，表示此溶液已不能使用。
(注5) 使用白陶土时，要对每批新的白陶土测定对Vc的回收率。
(注6) 样品中可能有其它还原性物质也可使染料还原。但其还原染料的速度较慢，故滴定终点以浅红色在15s不褪色为准。
17.2.3 维生素C总量的测定(2,4-二硝基苯肼比色法)
17.2.3 .1 方法原理
维生素C总量包括还原型Vc、脱氢型Vc和二酮古乐糖酸，将样品中的还原型抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸，进一步水解为二酮古乐糖酸。二酮古乐糖酸与2,4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎。其呈色的强度与二酮古乐糖酸浓度成正比，可以比色定量。
17.2.3 .2 主要试剂
1. 10 g·L-1草酸，20 g·L-1草酸；
2. 酸处理活性炭：取活性炭200g，加入1∶9HCl 1000mL，煮沸后，抽气过滤，再用沸水1000mL煮沸过滤，重复用水洗至溶液中无Fe2+离子(用10 g·L-1KSCN溶液试验无红色)，放在100~120℃烘干。
3. 20 g·L-1 2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4-二硝基苯肼(分析纯)2.00g溶解于100mL 4.5mol·L-1 H2SO4中。
4. 4.5mol ·L-1 H2SO4溶液：量取浓H2SO4(分析纯)250mL，慢慢倒入750mL水中，边加边搅拌。
5. 100 g·L-1硫脲溶液： 用500mL·L-1酒精溶液溶解5.00g硫脲(分析纯)，使其最终体积为50mL。
6. H2SO4(9∶1)溶液：量取浓硫酸90mL，慢慢倒入10mL水中。
7. 标准Vc溶液：称取维生素C(C6H8O5，分析纯) 20mg溶解于10 g·L-1草酸溶液中，移入100mL容量瓶中，并用10 g·L-1草酸溶液定容。吸取此溶液50mL，加入活性炭0.1g，摇1min，过滤。吸取此溶液5mL于100mL 容量瓶中，用10 g·L-1草酸溶液稀释定容。此Vc工作液为10mg·mL-1。
17.2.3 .3 操作步骤
1. 样品处理：称取适量样品(m)加等重量的20 g·L-1草酸溶液，在组织捣碎机中打成浆状。取浆状物20g用10 g·L-1草酸溶液移入100mL容量瓶中，定容过滤。
2. 样品中总Vc的测定：取滤渡10mL，加入10 g·L-1草酸10mL(总Vc约1~10mg·mL-1)，加一勺活性炭。摇1min，静置过滤。
各取滤液2mL于样品管和样品空白管中，各管加入1滴硫脲溶液(注1)。于样品管中加入2,4-二硝基苯肼0.5mL，两管都加上盖子，置于37℃保温箱中保温3h。
然后取出样品管放入冰水中(终止反应)。样品空白管取出后冷却至室温，然后加入2,4-二硝基苯肼0.5mL。
然后在样品管和样品空白管皆置于冰浴中，从滴定管中滴加9∶1硫酸溶液2mL于各管中，边滴边摇试管(防止溶液温度上升，溶液中糖炭化而转黑色)。
将各管从冰浴中取出，在室温下放置30min后(注2)，立即在分光光度计540nm 波长比色，读取吸收值，根据吸收值从标准曲线查出相应含量。
3. 标准曲线的绘制：吸取Vc标准工作液10，20，30，40，50mL稀释至50mL，即此系列含有2，4，6，8，10mg·mL-1的Vc标准溶液。各取2mL于各标准管中，以下操作步骤同上样品测定。以上述Vc浓度系列为横座标，以吸收值(A)为纵座标作标准曲线。
17.2.3 .4 结果计算
Vc总量(mg·kg-1 ) = r×20×1000/1000=r×20
式中 r—从标准曲线查得的总抗坏血酸的含量(mg ·mL-1)；
20—样品稀释倍数[(2m/m)×(100/20)×(20/10) = 20 ]；
1000—分别代表1000g样品中总Vc的含量和将mg换算成mg。
17.2.3 .5 注释
注1. 硫脲可防止Vc被氧化，且可帮助脎的形成，最终溶液中硫脲的浓度应一致，否则影响色度。
注2. 加入H2SO4(9∶1)溶液后试管从冰水中取出，溶液颜色会继续变深，所以必须准确加入H2SO4后30min内比色。
17.2.4 维生素B1和维生素B2的测定（液相色谱法）
维生素B1又名硫胺素，作为抗脚气病因素和抗神经炎因素，早已为人们所知[4]。它常以游离态、或作为焦磷酸盐存在于自然界中。它是熔点为246~250℃的白色结晶，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚和氯仿。硫胺素遇氧化剂或还原剂很不稳定，在干燥时较耐热，在酸性条件下(pH3.5)不易分解，在碱性条件下易分解。维生素B1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆、绿色蔬菜和牛乳、蛋黄、肝脏、猪肉中比较丰富，动物组织不如植物组织丰富。一般天然物中的维生素B1不但有游离型的，而且也有结合型的，在农产品中它常与淀粉、蛋白质结合在一起，要进行各种相应的前处理，使其成为游离型后，才可以进行测定。维生素B1可用灵敏度较高的硫色素荧光法[2,3,4,5,8,9]，紫外分光光度法、偶氮染料比色法和荧光目测法[8]等进行测定。
维生素B2又名核黄素、乳黄素，作用名为促进生长因素。它是橙黄色针状结晶，熔点为282℃的，耐热，对空气、氧气稳定，微溶于水，其水溶液呈黄绿色荧光，在强酸性和碱性溶液中则充分溶解。在酸性溶液中即使加热也很稳定，而在碱性溶液中则不稳定，特别是具有遇光易分解的性质。维生素B2在自然界中较多地存在于酵母、肝脏、蛋、牛乳、肉类中，在天然物中维生素B2不仅有游离型，还有与核酸结合在一起的。测定时要经适当的前处理，使其分离后进行测定。维生素B2的测定方法有分光光度法[8]、核黄素荧光法和光黄素荧光法[2,3,4,5,8,9]等。
随着仪器分析技术的发展，液相色谱法也应用于同时测定维生素B1和维生素B2，下面就此方法进行介绍。
17.2.4 .1方法原理
样品在稀盐酸溶液中经消化，用淀粉酶和木瓜酶分解样液中的淀粉和蛋白质后，即得到维生素B2的测定样液。此溶液在碱性铁氰化钾溶液中氧化后用异丁醇提取所得维生素B2测定样液。然后用YWG-C18柱乙晴-磷酸盐缓冲溶液作流动相，以荧光检测器进行液相色谱法测定，求出样品中维生素B1和维生素B2的含量。
17.2.4 .2仪器
1. 液相色谱仪：具有：?荧光分光检测器和记录仪；?色谱柱：不锈钢柱长为250mm，内径3.8mm。淤浆法填装YWG-C18H37 10m固定；
2. 微量注射器：5mL 和10mL。
17.2.4 .3 试剂
1. 乙晴和异丙醇，分析纯，重蒸；
2. 0.025mol·L-1磷酸盐缓冲液(pH=7.4)；
3. 流动相：流动相A，以磷酸盐缓冲液80份和乙晴20份相混而成；流动相B，以磷酸盐缓冲液82份和乙晴18份混合而成。
4. 碱性铁氰化钾溶液：吸取150g·L-1氢氧化钠溶液97mL加入10 g·L-1铁氰化钾3mL混合而成；
5. 混合酶溶液：取淀粉酶和木瓜酶各3g，用2 mol·L-1醋酸钠溶液稀释至100mL；
6. 维生素B1标准溶液：用0.01 mol·L-1盐酸溶液将符合药典的盐酸硫胺素配制成100mg·L-1 的标准溶液；
7. 维生素B2标准溶液：用0.01 mol·L-1盐酸溶液将符合药典的核黄素配制成25mg·L-1 的标准溶液；
8. 维生素B1和维生素B2混合工作液：取上述维生素B1和维生素B2标准溶液用0.01 mol·L-1盐酸溶液稀释至含维生素B1和维生素B2各2mg·L-1 的标准溶液。
17.2.4 .4 操作步骤
1. 样品处理：固体样品粉碎过20目筛，果蔬、肉类有水产品经捣碎备用。
称取试样1.00g(维生素B1和B2含量不低于0.5mg)于50mL棕色容量瓶中，加入0.1 mol·L-1盐酸溶液35mL，在超声波浴中超声3min或转动摇匀，在高压灭菌锅内121℃保持20~30min或置于沸水浴中加热30min，然后轻摇数次。取出，冷却至40℃以下，分别加混合酶液各2.5mL，摇匀，置于37℃下过夜或42~43℃加热4h，冷却，用水定容。样液经每分钟3000转速度离心过滤，取约10mL滤液备用。然后取滤液直接进行维生素B2测定(注1)。
取上述滤液5mL于60mL分液漏斗中，沿分液漏斗壁加碱性铁氰化钾溶液3mL(边摇边加)，继续振摇10s，立即加入异丁醇8mL，并猛烈振摇45s，静置分层后弃去水层。有机相通过无水硫酸钠小柱，其收集液为维生素B1待测液。
2. 标准溶液制备：准确吸取2mg·L-1维生素B1和维生素B2混合工作液0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00mL于50mL棕色容量中，再加入与样品等量的0.1mol·L-1盐酸，以下操作同样品处理，得到维生素B2标准系列水溶液和维生素B1标准系列异丁醇溶液。
3. 样品测定：
维生素B1的测定：首先调整液相色谱仪中激发波长为435nm，狭缝为10nm，发射波长为375nm，狭缝为12.5nm，灵敏度为10。使用流动相A，流速1mL·min-1。然后用微量注射器吸取标准系列溶液和样液为4mL或8mL(注2)，注入液相色谱仪中，得到其出峰保留时间和峰高。
维生素B2的测定：首先调整液相色谱仪中激发波长为440nm，发射波长为565nm，狭缝与维生素B1相同，灵敏度为3。使用流动相B，流速1mL·min-1。然后用微量注射器吸取标准系列溶液和样液为5mL，注入液相色谱仪中，得到其出峰保留时间和峰高。
由于采用等容量进样，以标准系列的峰高为纵座标，标准系列的维生素B1或B2含量(mg) 为横坐标作标准曲线。
17.2.4 .5 结果计算
维生素B1 或B2(mg·kg-1 )= m1 / m
式中： m1—由标准曲线查得相当于标准维生素B1或B2的质量(mg)；
m—进入色谱内相当样品质量(g)。
17.2.4 .6 注释
注1. 维生素B2 测定用消化后的滤液直接进样，处理后的标准和样品都有杂质峰，但能分离维生素B2，不影响测定。
注2. 由于维生素B1 被碱性铁氰化钾氧化并不是定量产生硫色素，但在恒定条件下是一个恒量。用异丁醇萃取的维生素B1 也是如此。因此本法采取等体积进样。
17.2.5 以b-胡萝卜素的测定
胡萝卜素是具有类似维生素A的生物活性和效力的物质，称维生素A原。胡萝卜素常有a、b、g几种异构体，其中以b-胡萝卜素的生理效能最大。在动物的小肠内、肝脏中转化为维生素A。结构式如下：
b-胡萝卜素
由此可见，一分子的胡萝卜素可分为二分子的维生素A，在实际效能上，一分子的胡萝卜素只相当于一分子的维生素A。胡萝卜素是脂溶性物质，易氧化，对热、酸不稳定。在紫外光照射下分解。但是在惰性气体中加入适当的抗氧化剂(如维生素E)，则可提高稳定性。
b-胡萝卜素是植物色素。存在于谷物、蔬菜、水果等食物中。以每百克可食部分计，小米0.12mg、玉米0.34mg、玉米面0.13mg、黄豆0.40mg、黄豆粉0.48mg、绿豆0.22mg、毛豆0.23mg。
因b-胡萝卜素是有色色素，可采用直接比色法定量分析。
17.2.5 .1 主要仪器：分光光度计，带塞烧瓶，分液漏斗，容量瓶。
17.2.5 .2 试剂
1. 水饱和正丁酮：5份正丁酮与1~2份水在分液漏斗中用力地进行摇动，静置分层，取上清液备用。
2. 乙醚。
3. b-胡萝卜素标准溶液：称取0.0250g粉末状的b-胡萝卜素置于已加入乙醚的带磨口瓶塞的100mL容量瓶中，使之溶解并稀释至刻度。取出20mL置于装有水饱和正丁酮的250mL容量瓶中，定容摇匀。再从中取出25mL用水饱和正丁酮稀释至100mL，即得5mg·mL-1的b-胡萝卜素标准溶液。
17.2.5 .3 方法原理
用水饱和的正丁酮萃取样品中的胡萝卜素，通过比色，求出样品中胡萝卜素含量(以b-胡萝卜素计)。
17.2.5 .4 操作步骤
1. 样品的制备和测定：取10.××g研磨过的样品悬浮于装有50mL澄清的水饱和正丁酮的200mL三角瓶中(使无块状物存在)，加塞，用力振荡1min。在室温条件下暗处放置一夜。次日晨，对沉淀物再进行充分摇匀。然后在遮光条件下通过细孔折叠滤纸漏斗过滤入另一个200mL三角瓶中。过滤时，为了避免蒸发损失，漏斗颈部下端要贴紧三角瓶瓶壁，并用表玻璃盖住漏斗。吸取黄色滤液于分光光度计425nm处比色测定(注1)，并在标准曲线中查出相应的b-胡萝卜素值(A)。
2. 标准曲线的绘制：分别吸取5mg·mL-1 b-胡萝卜素标准溶液0、 0.5、 1.5、 2.0、 2.5、 3.0 mL标准液于10mL带磨口塞的容量瓶中，用水饱和正丁酮定容摇匀，得0.0，0.25，0.75，1.00，1.25，1.50mg·mL-1 b-胡萝卜素标准溶液系列。于分光光度计425nm处比色测定。然后以吸光值为纵座标，以每1mL溶液所含的b-胡萝卜素量为横座标绘制标准曲线。
17.2.5 .5 结果计算
胡萝卜素含量[注2] (以b-胡萝卜素计，mg·kg-1) = r·V / m
式中：r—从标准曲线查得b-胡萝卜素的含量(mg·mL-1 )；
V—浸提液的体积(mL)；
m—样品的质量(g)。
17.2.5 .6 注释
注1. 若有其它色素干扰测定，可参考鲍士旦主编， 1996，《农畜水产品品质分析》，中国农业出版社，438~442。
注2. 胡萝卜素与维生素A的换算关系为：每3mg维生素A(醇型)或3.44mg 维生素A(酯型)=10000 I.U. (国际单位)，即1I.U. 维生素A=0.6mg b-胡萝卜素=0.3mg维生素A(醇型)。